春兰cg-miR159b的克隆及功能验证
1.选题来源
林业公益性行业科研专项“艳丽芳香型中国兰新品种定向培育及开发技术研究”
2.文献综述
春兰（Cymbidium goeringii Rchb.f.）是单子叶植物纲兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium Sw.）的地生植物。产于陕西南部、甘肃南部、江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、河南南部、湖北、湖南、广东、广西、四川、贵州、云南。生于多石山坡、林缘、林中透光处，海拔300-2200米，在台湾可上升到3000米。日本与朝鲜半岛南端也有分布；据报告印度东北部也曾发现，尚有待于进一步证实。模式标本采自日本。春兰是中国兰的主要种之一,花型奇特,与多数高等植物花器官单纯的萼片、花瓣、雄蕊群、雌蕊群不同,春兰从外向内依次为,花瓣状的萼片、两片侧瓣、高度特化的唇瓣、雄蕊群合生成高度特化的合蕊柱。正常的春兰花由3枚萼片、2枚侧瓣和1枚唇瓣,以及处于花器官中心部位的合蕊柱组成。蝶花通常是指2枚侧瓣或者2枚侧萼发生变异,质变成唇瓣样的花瓣,属于兰花花瓣的一种“唇瓣化”现象春兰的正常和蝶化花器官是研究单子叶植物花器官形成中花发育基因调控功能的理想材料[1-5]。miR159可调控植物的生长发育、抗逆响应等生理生化过程，但其对春兰的调控作用目前仍未可知。
2.1miR159的起源与作用机理
MicroRNA(miRNA)是一种非编码RNA，长度为20~24个nt的内源非编码小RNA,它们通过在转录后水平调控靶基因的表达,在植物的生长发育、逆境响应和环境适应等过程中起着关键作用[6]，普遍存在于动植物体内(包括单细胞藻类)。植物miRNA的生物合成过程是比较复杂的，包括3个步骤，分别是转录、加工成熟和功能复合体装配。
首先MIRNA基因由II型RNA聚合酶 (PolII)介导进行转录，形成初级miRNA[7]; 然后初级miRNA在细胞核内经III型RNA核酸酶DCL1、RNA结合蛋白 HYL1及锌指蛋白SE共同作用逐步切割形成具发夹结构的前体miRNA(pre-miRNA)[7];pre-miRNA再被DCL1/HYL1/SE进一步加工，变成双链片段miRNA;为避免双链片段miRNA/miRNA*被RNA酶降解，该双链两端的羟基在甲基化酶HEN1作用下被甲基化[8]。最后进行功能复合体装配，甲基化后的双链片段miRNA/miRNA*在转运蛋白HASTY(HST)的协助下，从细胞核转运到细胞质中，最后一条成熟miRNA单链与AGO蛋白结合，形成RNA诱导沉默复合体RISC[9]。RISC通过降解靶基因的mRNA或通过结合在3rsquo;UTR抑制其翻译，从而抑制靶基因活动[10-11]，因此miRNA的作用方式主要有两种:一是miRNA剪切靶基因mRNA;默复合体RISC[9]。RISC通过降解靶基因的mRNA或通过结合在3rsquo;UTR抑制其翻译，从而抑制靶基因活动，因此miRNA的作用方式主要有两种:一是miRNA剪切靶基因mRNA;二是遏制靶基因mRNA翻译。与哺乳动物miRNA作用方式相比，植物miRNA对靶基因的作用方式是剪切。
miRNA起源于陆生植物进化的早期，与陆生植物的出现和多样化相关联的保守基因家族，并在现代植物物种中得以保留，证明这些内源基因对于植物生物学至关重要，而miR159基因家族则是miRNA中的核心家族。目前研究发现该家族包括三个成员,分别是miRl59a、miRl59b、miRl59c,其中最主要的成员是miRl59a和miRl59b。miR159主要的靶基因为MYB类转录因子,常见的有MYB33、MYB65、MYB97、MYB101等[12]。国内外目前针对于miR159基因家族的研究表明众多单双子叶植物都有着高度相似的miR159基因家族，但在不同的植物中有着相当大的差异。
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