1文献综述
1.1研究背景
种子为大多数植物的主要繁殖器官，对个体繁殖和种群繁衍均很重要，种子休眠是植物长期演化的结果。芍药（Paeonia lactiflora）为芍药科芍药属芍药组的多年生草本植物，是原产我国的著名传统名花，在我国东北、华北、陕西及甘肃均有分布。其园艺品种繁多，是优良的鲜切花花材，根药用，称“白芍”，能镇痛、镇痉、祛瘀、通经，种子含油量约25%，可供制皂和涂料用。按照Nikolaeva对种子休眠的研究体系，引起种子休眠的原因主要包括：种胚发育不完全、种子代谢不启动等内源性原因以及种皮透性差、抑制物的存在、机械障碍等外源性原因。并且这些因素通常并非单一发生作用，而是相互作用，共同对种子的休眠造成影响。芍药属大部分植物在自然条件下发芽时间长达半年，究其原因是芍药属植物的种子具有上下胚轴双重休眠的特性。
1.2芍药种子休眠原因国内外研究进展
1.2.1种子休眠原因的研究
种子休眠是指具有生活力的种子在适宜的环境条件下仍然不能正常萌发的现象（杨苑钊，2020）。从根本上讲，种子休眠是在外界不良环境下产生的一种自我保护性反馈，是应对外界不良环境的适应性，有助于自身的存活与种群繁衍（杨萍和李晟锐，2020；Rajjou et al., 2012）。
影响种子休眠的原因有很多，按照不同的分类方式可以分为不同的原因类型。按照休眠产生的时间可分为原初休眠和次生休眠。原初休眠是指种子在成熟中后期自然形成的在一定时期内不萌发的特性；次生休眠，指本来没有休眠或已通过了休眠的种子，因不良环境而重新进入休眠，为环境胁迫导致的生理抑制（高荣岐等，2009）。一般新鲜采集的桦木科欧榛(Corylus avellana)种子休眠较浅，而贮藏一段时间(仅几天)后，将引起次生休眠，休眠加深（薛婷婷等，2018）。按照诱发休眠的部位不同，Nikolaeva将种子休眠分为外源性休眠、内源性休眠和综合性休眠。外源性休眠由种皮造成，内源性休眠由种胚造成，而综合性休眠由种皮和种胚综合引起，总共细分为七类（刘慧娜等，2020）。后来，Baskin和Baskin对这一分类系统进行了改进，这也是现在大多数学者认同的分类方式，改进后的种子休眠分为5种（Baskin et al., 2004），包括生理休眠、形态休眠、形态生理休眠、物理休眠和综合休眠。生理休眠指由于种胚生长势较弱，无法顺利穿透种皮萌发或者种胚中存在萌发抑制物质等而引起的休眠（刘慧娜等，2020）。根据休眠程度又可以分为深度、中度和非深度休眠。深度生理休眠的种子离体种胚不能正常生长，只能用3~4个月的低温层积来打破休眠，赤霉素（GA3）处理没有效果（Baskin et al., 2014）。中度生理休眠的种子离体种胚可以正常生长，2～3个月的低温层积和使用赤霉素（GA3）能解除休眠。非深度生理休眠的种子离体胚能正常生长，低温层积或者暖温层积以及赤霉素（GA3）可以解除休眠，促进萌发。青檀种子属于生理深休眠，种子萌发需要解除其生理休眠（洑香香等，2002）。形态休眠指种子成熟时，种胚尚未发育完全，种胚比较小，没有充满整个胚腔。种胚需要在适宜的环境中完成后熟，才能够顺利萌发。通常不同的树种，种子形态后熟所需要的环境条件不同。银杏、欧洲红豆杉和东北红豆杉都具有形态后熟现象（李晓琳和展晓日，2018）。形态生理休眠指种子既有生理休眠，也有形态休眠。这一类种子种胚没有发育完全，种子中也存在发芽抑制物质。形态生理休眠是最为复杂的一种类型，根据种子萌发的冷或暖层积需求、胚生长的温度需求、胚根及上胚轴胚芽出现的时间、对赤霉素的反应，形态生理休眠现可分为非深度简单、中度简单、深度简单、非深度简单上胚轴、深度简单上胚轴、深度简单双重、非深度复杂、中度复杂和深度复杂九个类型（Baskin et al.，2014）。棕榈科 (Arecaceae)、天门冬科(Asparagaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)和伞形科(Apiaceae)的大部分植物都具有形态生理休眠（姚林君等，2019）。物理休眠指种皮或果皮障碍引起的休眠，种皮或果皮不透气不透水，阻碍了种子的萌发。物理休眠的实质是在种子成熟期，由于脱水，细胞内的物质发生胶体变化，从而形成致密不透水结构。大多数豆科植物种皮都具有硬实性，巨紫荆（Cercis gigantea）种子表皮坚硬，对种子产生机械障碍作用，从而导致种子休眠（陈镇等，2018）。综合休眠指既有物理休眠，也有生理休眠。种皮或果皮不透气透水，同时种子内含有抑制物质。椴树属紫椴(Tilia amurensis)种子就属于综合休眠类型，其种皮坚硬致密，并且种子内含有抑制萌发的物质（韩友志，2020）。
1.2.2种子休眠机理的研究
种子的休眠与萌发是高等植物生长发育进程中非常重要的环节，是维系物种繁衍的重要过程。关于种子休眠特性和机理的研究，一直是国内外种子生理学家和科学工作者研究的重点内容之一。目前提出的假说主要有激素调节学说、代谢途径学说、基因表达调节学说、光敏素学说等。激素调节学说是指激素在种子休眠过程中起着十分重要的作用，国内外许多学者十分重视对激素的研究。比较著名的学说是Khan提出的“三因子学说”，赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）、细胞分裂素（CTK）在种子休眠与萌发过程中起着调控作用（Khan, 1975）。GA是促进萌发的主要物质，ABA抑制萌发，CTK能够降解ABA，起到解除抑制的作用。Khan认为在具有正常发芽能力的种子均含有一定浓度的GA，但由于种子中也含有一定浓度的ABA，GA对种子萌发的促进作用则会被阻碍，如果种子中同时含有CTK，则ABA的抑制作用将被解除，从而促进种子的萌发。刘晏等（2020）提出种子由休眠状态转变为萌发状态的过程实际上是种子内部和外界环境因子的共同调节作用的结果，在这一过程中环境因子调控内源组分从而影响种子的萌发。激素通过调控相关基因的表达和细胞信号的转导以实现其生物学功能。在种子由休眠向萌发转变的过程中，在细胞信号转导作用下，一系列蛋白质、酶的代谢受到调控（刘晏等，2020）。ABA通过控制胚根的萌发，抑制细胞壁的松动和膨胀来控制种子的萌发（Gimeno-Gilles et al., 2009）。种子发育初期主要进行胚的扩张以及物质的储存，GA可以加速这两个进程的完成。当种子处于萌发后期时，GA对胚乳等屏障组织的软化作用促进水解酶的表达，这种变化可以从一定程度上降低种子胚根尖的机械阻力，进而促进胚根对种皮的突破（Holdsworth et al., 2008）。种子的休眠与萌发主要是受这两种激素的调控作用。其它激素主要通过参与调控ABA的生物合成或信号转导影响种子的休眠与萌发。代谢途径学说是指植物体内最主要的三条呼吸代谢途径是糖酵解途径(EMP)、三羧酸循环(TCA)以及磷酸戊糖途径(PPP)。关于PPP途径在解除种子休眠中的可能作用首先是由Major（1968）提出的，Gaber在研究了休眠和不休眠的大麦中PPP的相对活性后证实了这种观点。随后Simmonds和Simpson（1971）以及Black（1988）对野燕麦休眠过程中糖代谢途径由EMP/TCA到PPP的转变和G6PDH活性的测试都证明，在休眠和不休眠的大麦品种中，氧消耗量和脂肪含量均近似，所以代谢途径由EMP/TCA转向PPP才是休眠解除的原因。PPP途径是生物利用能量的主要途径，可以产生DNA、RNA的前体物质，这些物质是种子发芽所必需的。其他许多研究用呼吸抑制剂处理种子，都加速了种子休眠的解除。这说明了种子休眠的解除取决于某些氧化反应而不是通常的呼吸作用（赵永华等，2001）。基因表达调节学说是指随着从生理层面上研究种子休眠的深入，许多学者开始转向基因层面的研究，逐渐意识到基因表达与休眠有着紧密联系，这也是目前研究种子休眠的主要趋势之一。早在上世纪八十年代，藤伊正提出休眠期间的植物器官进行着核酸的代谢，并认为休眠是由于DNA活性下降或受到抑制，或是由于蛋白质合成过程中RNA活性下降或受到抑制，并且还推论器官休眠至少是缺乏某种mRNA（藤伊正，1980）。随后越来越多的学者在基因层面展开研究。其中，miRNA作为小分子的非编码RNA，可以通过对相关表达基因的调控作用影响植物的生长发育，在植物发育、信号传导以及环境胁迫等方面都具有重要的调控作用，其表达具有时空特异性（高季平，2017）。与种子休眠与萌发相关的miRNA及调控功能已在不同植物中被发现，例如miR159在拟南芥中通过靶向MYB基因调控种子对ABA的敏感性，miR159过表达从而抑制MYB33和MYB101转录，导致种子对ABA信号不敏感（Nonogaki, 2010）。miR156作为调控植物幼年向成年阶段转变的主要因子，通过靶标SPL13调控miR172的表达，而miR172又会抑制AP2表达，两者交互作用，调控相关基因（如DOG1)，促进或延迟种子萌发；miR160可通过靶标ARF10、ARF16和ARF17基因介导种子对ABA的敏感性，而ABA与生长素在种子休眠和萌发中发挥着重要的作用，因此miR160通过生长素等植物激素信号传导来调控种子的休眠与萌发（魏俊等，2017）。光敏素学说是指光敏素（PHY）最早发现于上世纪三十年代，Flint和Mc Alister研究发现光敏素的存在。Borthwick随后就光敏素调节休眠做了详细阐述，红光能够促进需光种子的萌发，远红光则促使种子休眠（傅家瑞，1985）。PHY在黑暗条件下以生理失活的红光吸收型(Pr)存在，吸收红光之后转变成其生理激活型(Pfr)。两种光吸收型的PHY在Pr和Pfr两种状态间相互转变。目前有研究表明，与黑暗条件下相比，红光、远红光以及蓝光处理的种子均能正常萌发。说明除红光和远红光外，蓝光亦能调控种子萌发（杨立文，2019）。对光信号调控种子休眠与萌发也是近年来国内外学者比较关注的问题，但目前的研究并不深入，还需要以后进一步的研究。
1.2.3芍药种子休眠的研究
芍药种子休眠的原因大体上可以分为种子内存在抑制物质和种皮及其附属物造成障碍。在芍药种子中是否存在抑制物质影响种子萌发的研究方面，关雪莲等通过块根芍药种子抑制物对白菜种子萌发实验，通过芍药种子提取液对白菜种子萌发和幼苗建成的影响，证明块根芍药种皮和种胚中存在抑制物，可能会导致种子休眠。通过了生物学测定、系统分离及GC-MS鉴定的方法，张少强对芍药种子中的萌发抑制物进行了研究，再次印证了芍药种子中存在萌发抑制物，并确定了芍药种子系统分离各项所含有的抑制物质。
早期的研究表明，对芍药种子进行机械破皮处理，可以打破其休眠，促进种子萌发。种皮的透水和透气性是影响种子萌发的重要因素，电镜观察结果显示芍药种子的种皮细胞排列紧密，细胞间间隙小，这种种皮结构不利于种子的透水透气，可能会导致芍药种子萌发困难。实验发现破皮的芍药种子透水率和透气率均明显高于完整的种子，再次印证了芍药种子种皮对种子透水透气的阻碍作用。
1.2.4解除芍药种子休眠方法的研究
种子休眠是存在于大多植物中的一种现象，绝大多数正常型种子和少部分顽拗型种子中都存在休眠现象（李磊等，2016）。种子休眠是一个十分复杂的过程，虽然对于林木本身来讲，是对恶劣环境的一个抵御措施，有利于自身生存与种群繁衍。但对于生产上来讲，会带来很大的播种育苗困难。因此，解除种子休眠对于农业生产、造林及苗圃繁育工作有着十分重要的意义。除种子休眠的方法因休眠原因的不同而异，由于芍药具有上、下胚轴双重休眠的特性，解除芍药种子休眠总体上可以分为解除上胚轴休眠和解除下胚轴休眠两个过程。
2研究目的及技术路线
2.1研究目的
从上胚轴和下胚轴两方面，研究芍药种子脱水敏感性及相关的生理生化变化，详细探究芍药种子休眠的原因，为探究打破芍药休眠方法、种子贮藏、种质资源的保存及苗木生产提供理论依据。
2.2研究方法
2.2.1种子基本生物学特性测定
2.2.1.1种子形态特征观测
种子横、纵径：采用四分法随机选取4times;50粒新鲜芍药种子，用游标卡尺测量，精确到0.01 mm；
