荧光法在多肽药物开发中的应用文献综述

开题报告内容：

一、课题解决的问题

小分子活性肽是介于氨基酸和蛋白质之间的一种物质，是由多个氨基酸聚合而成的短链。相比较小分子药物而言，多肽药物的稳定性较差，基于多肽分子的特性，有些多肽具有成纤维聚集的性质，影响药品使用的安全性^［1］。硫磺素T是一种能够与蛋白聚合体中beta;片层特异结合的荧光染料，可通过荧光方法设计实验考察多肽药物是否发生成纤维聚集，为多肽药物制剂的处方和工艺开发提供依据。

在多肽药物的研发中，由于多肽的诸多特点，造成了其在制备、分析、使用、储存过程中的难点和挑战。本文章专注于采用荧光法考察多肽药物的纤维凝聚性质，从而为改良多肽药物制剂的处方和工艺方法提供依据。

二、国内外研究现状及发展趋势

与传统的化学药物和蛋白质类似药物相比，多肽药物具有活性显著，特异性较强，与受体的亲和性好，毒性较弱且不易在体内蓄积；与蛋白类大分子药物相比，除了多肽疫苗外，多肽类药物免疫原性相对较小，用药剂量少，单位活性更高，易于合成、改造和优化，产品纯度高，质量可控，能够迅速确定药用价值^［2］。多肽药物分子结构小、易改造、易合成，其生产无需大流程装置，普通大型实验室即可达到生产条件，且生产过程中排放的废物少，属于绿色制药，因此多肽药物是21世纪最有发展前途的药物之一 ^[3-5]。近几年，全球多肽药物市场整体处于发展上升期，市场规模复合增速达 12% 以上，市场规模达到280多亿美元。因为多肽在机体内扮演的角色多种多样，参与众多生理功能，所以多肽药物的发展前景不可限量。据不完全统计，有约500多个多肽产品在全球进入开发阶段，约73种多肽产品，在美国和其它国家获批，150多种多肽在临床阶段，近一半在临床二期，每年陆陆续续都有新的多肽药物获批^［6］。在80年代早期所研发的多肽长度大多不超过10个氨基酸，现在近几十年内有所增加，趋向于40个氨基酸甚至更长。2019年口服索马鲁肽在美国FDA获批轰动业内，因为长度较大的多肽类药物，想要实现口服、肠道吸收就必须面临肠道中多种肽酶降解的挑战，口服索玛鲁肽的获批无疑为业界在新剂型的多肽药物的开发方面起到了里程碑意义的示范作用^［7］。未来多肽药物的研发除了基于剂型的改变和优化，新的多肽药物递送方式、半衰期被延长的修饰化或融合多肽药物将推动此类药物分子的发展^［8］。正在进行临床试验的128个候选多肽药物中，已有40个进入Ⅰ期临床，74个进入Ⅰ/Ⅱ期或Ⅱ期临床，14个进入Ⅱ/Ⅲ期或Ⅲ期临床，而处于Ⅰ期和Ⅱ期临床研究阶段的多肽药物在代谢类疾病和肿瘤治疗领域占主导地位，Ⅲ期临床研究中的多肽药物在肿瘤和感染疾病治疗领域占多数，其中抗肿瘤多肽药物占40%以上^[9]。

三、研究方法和技术路线

1、研究方法

第一，文献研究法。通过阅读大量有关荧光法在多肽药物应用的文献，加深了对本文选题荧光法在多肽药物中的应用的研究综合地质调查各方面的认识，为后期采集数据及研究奠定很好的理论基础。第二，实证分析法。通过现场采集数据并在前人的研究基础之上，突出定性分析与定量分析相结合、基础理论研究和具体实证分析相结合，力求研究成果具有理论创新性、科学性和可行性。

2、技术路线

第一、阅读相关参考文献，熟悉相关内容，为后面的实验奠定良好的理论基础。第二、熟悉相关的操作，为后面的实验过程做好准备工作。第三、按照预定计划进行相关实验，获取实验数据。第四、进行数据处理工作，并得到相关结果。第五、撰写论文，得出结论。

四、论文课题研究进度安排

2013年3月04日----3月10日 确定选题，查阅文献。

2013年3月10日----3月18日 撰写开题报告。

2013年3月18日----4月1日 进行调查、收集资料、进行分析设计。

2013年4月1日----5月15日 设计系统原型，并提交论文初稿。

2013年5月20日前 修改论文，完善系统

2013年5月30日前 提交正式毕业设计以及相关成果，并进行论文答辩准备。

五、文献综述

许多神经退行性疾病(NDs)，如帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)等，均与神经细胞内病理蛋白质的淀粉样纤维化密切相关。淀粉样纤维是指发生错误折叠的蛋白质形成的一类由beta;折叠片构成的丝状蛋白聚集体，机体内淀粉样纤维形成的斑块沉积长期被认为是导致一系列神经退行性疾病的根本原因^［10］。荧光物质的荧光寿命与自身的结构、所处微环境的极性及黏度等条件有关，因此利用荧光寿命可以直接了解研究如超分子体系中分子间的簇集、蛋白质高级结构等的体系变化。目前，常用荧光染料硫磺素T的稳态荧光光谱检测、鉴定蛋白质在体外形成的纤维聚集体以及原位、组织学标本中的纤维。ThT在不同溶液中的荧光寿命具有明显的差异，因此，可利用时间分辨荧光技术检测不同形态蛋白聚集体的ThT荧光寿命，以区分蛋白单体、寡聚体和纤维样聚集体，并监测蛋白在聚集过程中形成的寡聚体物质。先前报道红细胞存在淀粉样纤维，可采用ThT为荧光材料，分析AD患者成熟中性粒细胞的淀粉样变形成^［11］。

在另一个研究方法中，Sirtuin蛋白是一类称为依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的组蛋白去乙酰化酶，共有7个成员，均是潜在的疾病治疗靶点。然而，目前的荧光筛选方法，只适用于SIＲT1～SIＲT3^［12］。因此，根据 SIＲT5 的新酶活，设计、合成了针对 SIＲT5的荧光标记多肽( ISGASE( SuK) -AMC) ，并通过 LC-MS 和荧光检测证明了该荧光标记多肽能应用于 SIＲT5 的活性筛选^［13］。也可通过合成制备 3 种探针，测定其紫外－可见吸收光谱和荧光光谱; 测定探针与溶液中Abeta;聚集体混合前后的荧光光谱; 测定探针与转基因小鼠脑内 Abeta; 聚集体混合后的荧光染色。结果通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱及高分辨率质谱确证了探针的结构。探针与溶液中 Abeta; 聚集体混合后，荧光强度增强，可用于溶液和生物组织中 Abeta; 聚集状态的荧光增强检测^［14］。为了更好地掌握药物在体内的吸收代谢，可使用荧光酶标仪进行检测^[15]。

抗AD药物托卡朋能抑制 Abeta;42 聚集并降低 Abeta;42 聚集物诱导的细胞毒性，但临床研究发现托卡朋有很强肝毒性。为了降低托卡朋的肝毒性，对其侧链结构进行改造并获得其衍生物苯乙基(E)-2-氰基-3-(3,4二羟 基-5-硝基苯)-丙烯酸酯（PCDNA）。通过硫磺素 T和原子力显微（atomic force microscopy, AFM）实验研究了 PCDNA 对 Abeta;42 纤维化的抑制作用；通过细胞毒性实验研究了 PCDNA 对 Abeta;42 聚集物诱导的细胞毒性作用；并研究了 PCDNA 对成熟 Abeta;42 纤维的解聚作用。最后，通过分子对接实验研究 了 PCDNA 与 Abeta;42 五聚体之间的相互作用。这些实验结果为研究托卡朋结构类似物作为 Abeta; 抑制剂奠定了基础^［15］。

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