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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 研究背景： 药物分子需要到达细胞表面或被细胞摄取后才能发挥作用。然而，根据给药方式的不同，纳米粒会面临不同的生理屏障。例如，口服药物载体需要克服黏液屏障才可被肠道上皮吸收[1]，而靶向肿瘤细胞的药物载体需要穿透肿瘤组织中致密的细胞外基质（ECM）才能到达细胞表面[2]。在这样的背景下，生物凝胶（肠道黏液和肿瘤细胞外基质）的重要屏障作用越发受到人们的关注[3]。 肠道黏液作为药物口服吸收的一道重要物理屏障，主要由黏蛋白、脂类、无机盐等构成的复杂黏弹性水凝胶，厚度为10-200 mu;m[4]。黏液分为固有黏液层（内层）和疏松黏液层（外层），固有层紧密附着于肠上皮细胞，厚度约为7 mu;m；疏松层附着性不强，在结肠处较厚约为40-100 mu;m，小肠处较薄约为10 mu;m。口服给药的纳米粒通过疏水作用力和静电力与黏蛋白作用，多被束缚在疏松外层黏液中，并随着外层黏液的更新而被机体清除[5]。此外，肠上皮细胞调节物质从肠腔进入体循环和淋巴循环，也是限制纳米粒入血的重要生理屏障，使药物的口服生物利用度降低[6]。除黏液外，作为肿瘤微环境的重要组成部分，细胞外基质也是一种生物凝胶，主要由胶原蛋白、明胶、黏多糖等[7]构成，是一种致密的网状结构，能够阻止纳米粒的有效渗透。纳米粒能否克服这些生物凝胶及细胞质膜屏障，进入细胞内部直接影响了其最终疗效。 近年来，越来越多的研究聚焦于仿生纳米载体的设计，其中形状仿生也是较为有效的仿生策略之一，例如盘状的仿生红细胞纳米粒改善肿瘤乏氧[8]以及棒状的仿生肠道细菌纳米粒促进口服吸收[9]等。介孔氧化硅纳米粒由于载药量高、大小形状可调且表面易于修饰等特点[10]，已经而成为研究纳米粒物理化学性质对其递药效率影响的重要模型粒子。 因此，本课题拟设计尺度和表面性质相同、形状不同（球状、棒状、盘状）的介孔氧化硅纳米载体，利用超高分辨显微术、多粒子追踪等技术考察各形状纳米粒的克服生物凝胶-细胞双重屏障的递药效率，以期筛选出具有优势递药能力的形状因素，为后续的载体优化设计奠定基础。 研究内容： 1、制备尺度和表面性质相同、形状不同（球状、棒状、盘状）的介孔氧化硅纳米粒，并表征其粒径、电位和表面形貌； 2、考察纳米粒的形状因素对于其克服生物凝胶屏障的能力，即肠道黏液穿透能力和肿瘤组织细胞外基质（ECM）渗透能力的影响； 3、考察纳米粒的形状因素对于其克服生物凝胶-细胞双重屏障后的细胞摄取效率的影响； 实验方案： 1、相同尺度、不同形状的介孔氧化硅纳米粒的制备和表征 1.1制备粒径为200 nm的球状、棒状（AR=3）和盘状纳米粒 球状：将KH2PO4（0.686 g）和NaOH（0.116 g）溶解于100 ml去离子水中，然后加入CTAB（0.32 g）和PT（9 mL），形成胶束后，加入TEOS（1.8 mL），反应8 h。将所得溶液离心，用乙醇清洗三遍。所得粒子重悬于乙醇，加入1 mL盐酸，搅拌过夜去除CTAB。 棒状（AR=3）：将CTAB（0.22 g）溶解于54 mL去离子水中，然后加入NH4OH（850 mu;L）碱化溶液，搅拌1 h。逐滴TEOS（470 mu;L）后，室温下反应3 h。将所得溶液离心，用乙醇清洗三遍。所得粒子重悬于乙醇，加入1 mL盐酸，搅拌过夜去除CTAB。 盘状：以九水合硝酸铝和六水合硝酸镁为原料制备水滑石。以水滑石为模板，TEOS为硅源制备LDH@SiO2，用浓硝酸溶液处理LDH@SiO2，离心，水洗三次，超声复悬后真空干燥即得空心盘状介孔硅。 1.2罗丹明B异硫氰酸盐（RITC）标记介孔氧化硅纳米粒 将RITC和APTES于乙醇溶液中共价连接，加入20 mg介孔氧化硅纳米粒反应8 h，将溶液离心，用乙醇清洗，超声三次去除未连接的RITC和APTES。 1.3用马尔文粒度仪测量粒度和zeta;电位 1.4透射电子显微镜（TEM）观察粒子形状和大小 2、离体组织黏液穿透性评价 2.1肠道黏液中的多粒子追踪考察粒子扩散速率 收集大鼠小肠段的黏液，滴加5 mu;L纳米粒（100 mu;g/mL）后37 C下孵育30 min，使用荧光倒置显微镜拍摄离子在黏液中的运动视频。 2.2三维视角观察纳米粒黏液穿透性 使用Alexa Fluor 488 conjugated-WGA对黏液进行染色，缓慢滴加100 mu;L含有DiI标记纳米粒（100 mu;g/mL）的PBS溶液，将肠段在37 C的KH溶液中孵育30 min。通过共聚焦荧光扫描显微镜对黏液层中的纳米粒分布进行三维重构。 3、体外细胞实验 3.1测定各纳米粒在Caco-2和E12细胞中的摄取能力 Caco-2细胞摄取实验（细胞屏障）： 将Caco-2细胞以104/孔的密度种于24孔板中，培养24 h。将细胞与DiI标记的250 mu;g/mL纳米粒孵育2 h，用PBS清洗细胞三次，并用多聚甲醛固定20 min，加入DAPI溶液室温下孵育20 min，使用共聚焦荧光扫描显微镜观察样品；标记纳米粒后，加入细胞裂解液，通过流式细胞术进行分析，得到定量结果。 E12细胞摄取实验（黏液-细胞双重屏障）： 将E12细胞分为两组，一组预先加入NAC除去黏液层，另一组用PBS清洗保留黏液层。两组细胞与DiI标记的250 mu;g/ml纳米粒孵育2 h，加入细胞裂解液，收集样品并用流式细胞术定量分析；细胞与纳米粒孵育1 h后，加入Hoechst对细胞核进行染色，使用Alexa Fluor 488 conjugated-WGA对黏液进行染色，随后细胞用HBSS清洗两次，并用共聚焦荧光扫描显微镜进行观察。 3.2考察各纳米粒在肿瘤球中的渗透能力 48孔板每孔加入150 mu;l无菌琼脂糖溶液，冷却至室温。BxPC-3和HPSC细胞以1：1的比例、1*104/孔的密度种于48孔板中，然后培养板轻微摇动5 min，37℃孵育4天直到形成粒径均匀为300-400 mu;m的肿瘤球。将肿瘤球与RITC标记的纳米粒在37℃下孵育2 h。肿瘤球用PBS清洗三遍，用4%多聚甲醛固定30 min，使用共聚焦荧光扫描显微镜观察纳米粒在肿瘤球中的渗透。 参考文献： [1] Fan, W., Xia, D., Zhu, Q., Hu, L. amp; Gan, Y. Intracellular transport of nanocarriers across the intestinal epithelium. Drug Discov Today 21, 856-863, doi:10.1016/j.drudis.2016.04.007 (2016). [2] Ishii, G., Ochiai, A. amp; Neri, S. Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment. Advanced Drug Delivery Reviews 99, 186-196, doi:10.1016/j.addr.2015.07.007 (2016). [3] Yu, M., Yang, Y., Zhu, C., Guo, S. amp; Gan, Y. Advances in the transepithelial transport of nanoparticles. Drug Discov Today 21, 1155-1161, doi:10.1016/j.drudis.2016.05.007 (2016). [4] Ensign, L. M., Cone, R. amp; Hanes, J. Oral drug delivery with polymeric nanoparticles: the gastrointestinal mucus barriers. Adv Drug Deliv Rev 64, 557-570, doi:10.1016/j.addr.2011.12.009 (2012). [5] Lundquist, P. amp; Artursson, P. Oral absorption of peptides and nanoparticles across the human intestine: Opportunities, limitations and studies in human tissues. Advanced Drug Delivery Reviews 106, 256-276, doi:10.1016/j.addr.2016.07.007 (2016). [6] Yang, Y., Nie, D., Liu, Y., Yu, M. amp; Gan, Y. Advances in particle shape engineering for improved drug delivery. Drug Discov Today 24, 575-583, doi:10.1016/j.drudis.2018.10.006 (2019). [7] Syggelos, S. A., Aletras, A. J., Smirlaki, I. amp; Skandalis, S. S. Extracellular matrix degradation and tissue remodeling in periprosthetic loosening and osteolysis: focus on matrix metalloproteinases, their endogenous tissue inhibitors, and the proteasome. Biomed Res Int 2013, 230805, doi:10.1155/2013/230805 (2013). [8] Gao, C. et al. Red Blood Cell-Mimicking Micromotor for Active Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces 11, 23392-23400, doi:10.1021/acsami.9b07979 (2019). [9] Yu, M. et al. Rotation-Facilitated Rapid Transport of Nanorods in Mucosal Tissues. Nano Lett 16, 7176-7182, doi:10.1021/acs.nanolett.6b03515 (2016). [10] Feng, Y. et al. The application of mesoporous silica nanoparticle family in cancer theranostics. Coordination Chemistry Reviews 319, 86-109, doi:10.1016/j.ccr.2016.04.019 (2016). 学生签名： 年 月 日 |
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指导教师意见： 近年来，形状效应对纳米粒给药过程中的影响已经成了热点研究之一，研究结果表明纳米粒形状能够影响其细胞摄取、血液循环时间等等生物效应。以往研究主要关注细胞对纳米粒摄取效率的提高，然而形状效应对于纳米粒克服生物凝胶-细胞双重屏障的综合影响的研究仍旧不足。本课题拟制备相同尺度、不同形状的介孔氧化硅纳米粒，并考察其在克服生物凝胶-细胞双重屏障时的形状效应以及具体微观机制，筛选出具有优势递药能力的形状因素，为后续的载体优化设计奠定基础。该课题选题新颖具有创新性，为国内外本领域研究前沿。 该生对所选课题进行了较为详尽的文献调研，相信该生能够在预期的时间内完成该课题的设计项目。 |
