中国药科大学毕业论文开题报告
论文题目：HSP90突变体的构建及其功能的初步研究
热休克蛋白90(Hsp90)是生物进化过程中的一类高度保守的蛋白质，作为分子伴侣对细胞中众多信号蛋白的构象成熟和功能稳定进行调控。近年来的研究表明，Hsp90与多种疾病的发生发展、生物学行为及其预后有密切的关系，一方面已被认定为一个全新的肿瘤标志物，另一方面Hsp90在大脑细胞中的作用已经成为了研究的热点。
Hsp90在胞浆内主要以同源二聚体alpha;-alpha;和beta;-beta;的形式存在，每个同源二聚体由2个单体构成。Hsp90alpha;和Hsp90beta;分别由730和724个氨基酸组成，其同源性为84%，二者氨基酸序列的主要差别在于：Hsp90alpha;的氨基酸末端有一五氨基序列(QTQDQ)，而Hsp90beta;无此序列。Hsp90alpha;和Hsp90beta;对不同诱导因素的响应也有所不同，相比之下，前者易受热诱导，在肿瘤细胞增殖中起重要作用，而后者更易受有丝分裂的诱导，与细胞分化和结构构建有关，许多肿瘤细胞中Hsp90alpha;高表达增高，而Hsp90beta;表达基本不变。
本次实验需要分别制备野生型和突变型HSP90质粒。首先通过Nhe I 及Xma I双酶切和T4酶连接的方法，将人HSP90beta;基因插入pEGFP-N1质粒中。然后人工设计两组引物，一方面使用正常引物，通过PCR的方法从重组模板质粒中扩增得到野生型HSP90-EGFP片段，另一方面使用正常引物及突变引物，通过巢式PCR从模板质粒中扩增得到突变型HSP90-EGFP片段。通过DNA琼脂糖电泳验证PCR结果。PCR产物经过纯化后，建立酶切体系，利用cla I限制性内切酶切出粘性末端。其次，将腺相关病毒载体（AAV）通过非甲基化感受态细胞转化，涂板并摇菌，通过质粒小提得到AAV质粒。切胶回收后，利用cla I酶切割，得到具有粘性末端的AAV载体。载体经过纯化与去磷酸化，与之前得到的野生型的突变型插入序列分别连接。连接产物用DH5alpha;进行转化，涂板摇菌并通过DNA琼脂糖电泳验证连接结果。阳性产物可通过PCR及基因测序的方法验证连接是否成功。通过这一过程得到人工构建的野生型Hsp90-EGFP-AAV质粒及突变型Hsp90-EGFP-AAV质粒。此后，通过体外包装病毒，转染293T细胞（人肾上皮细胞），研究Hsp90野生型与突变型的功能及对细胞蛋白表达的影响。
通过本次实验，我的目的旨在掌握各种分子克隆的方法以及细胞细菌培养，转化转染的方法。能够熟练进行PCR,酶切连接，质粒提取，DNA琼脂糖凝胶电泳，western 电泳等实验操作，依据各种基因片段的不同性质选择合适的克隆方法。还有各种人工设计引物的方法，熟练操作PCR仪，紫外线照胶仪和核酸浓度测定仪，对未知基因的序列信息进行测定。
主要参考文献：
HSP90突变体的构建及其功能的初步研究
[1]孟帅,山广志,李卓荣.Hsp90抑制剂的研究进展[J].中国抗生素杂志,2011,04:241-248.
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