长春花胁迫响应基因CrTCP12的克隆及功能分析
摘要：长春花(Catharanthus roseus)属于夹竹桃科、长春花属，是多年生草本植物，可产生130多种具有重要药用价值的萜类吲哚生物碱（TIAs），大多数萜类吲哚生物碱具有药用价值，如抗肿瘤药物长春碱和抗肿瘤长春新碱；还有单吲哚生物碱如长春质碱可以起到降血糖的效果，可用于治疗糖尿病；又如文多灵碱和长春质碱均具有抗菌活性、抗糖尿病和利尿的功效。并且大多数生物碱具有生理学活性，作为天然植物无毒副作用，被广泛应用于现代医药行业，也是目前国际上应用最广泛的抗癌植物，因此长春花具有很高的开发应用价值，对长春花生物碱的需求量也越来越大。
但野生长春花中生物碱含量普遍偏低；长春花的毛状根和悬浮细胞中由于无文多灵合成相关的酶，导致不能合成具有抗肿瘤活性的长春碱和长春新碱。生物碱普遍参与逆境胁迫响应，当植物受到生物与非生物胁迫时，便会快速合成生物碱来响应逆境胁迫，但遗传和代谢产物不稳定。另外这些生物碱结构复杂，人工合成难度大、成本高、产量低，使长春花萜类吲哚生物碱大规模商业化生产受到限制。所以长春花生物碱合成途径基因调控的研究和提高长春花生物碱合成含量的研究显得尤为重要。
关键词：长春花； 萜类吲哚生物碱； 逆境胁迫；合成途径
- 文献综述
药用、观赏植物长春花(Catharanthus roseus)是属于次生代谢物质含量相对较高的夹竹桃科植物，是长春花属中的一种多年生草本植物[1]，原产亚洲南部、非洲东部以及美洲热带区域，在宋朝时期传入中国，早年主要分布在江苏、浙江和台湾等沿海地区，现如今中国的西南、中南及华东地区都有种植，其中海南岛是中国种植的最优地区。另外其花型以及可连续开放的特点使其成为很受欢迎的园艺植物[2]。长春花能够产生大量次生代谢产物，这些代谢物从化学结构来看主要是属于萜类生物碱，这类生物碱具有非常重要的药用价值[3]，目前已经从长春花中分离并鉴定出130种以上的萜类吲哚生物碱（TIAs），这些吲哚生物碱主要是二萜类长春碱（Vinblastine）、长春新碱(vincristine)和单萜类阿玛碱（ajmalicine)、文多灵(vindoline)等[4]。同时长春花的各个组织、器官均能合成生物碱，如叶片中含有长春碱和长春新碱，根中含有阿玛碱和蛇根碱，即使是长春花种子也含有长春花拉胺（vingramine）和甲基长春花拉胺（meth-ylvingramine）等生物碱，当然在长春花不同器官中含有的生物碱成分及其含量可能也不尽相同。长春花体内的所有生物碱按化学结构可以归纳为３种化学类型：单萜类（如阿玛碱和文多灵等）、二氢萜类（如长春质碱和蛇根碱等）和双萜类（如长春碱和长春新碱等）。自从发现长春碱和春新碱对小鼠白血病有显著疗效以来，长春花生物碱对肿瘤的抗性作用的研究越来越受到人们的关注[5]。目前长春花体内的大多数生物碱由于它们各自独特的药理作用在现代医疗领域已经得到了广泛的应用，如长春碱和长春新碱这两种二萜类生物碱由于其具有抗肿瘤活性，成为目前在医疗上应用最为广泛的两种天然植物抗肿瘤药物，现已广泛应用于何杰金氏病、恶性淋巴肿瘤、急性淋巴细胞型白血病、绒毛上皮细胞癌以及一些其它癌症的治疗，它们的硫酸盐类化合物临床医疗上同样得到了广泛应用。长春新碱和长春碱的化学结构也非常相似，并且具有极其相似的药用功效，但他们的抗肿瘤谱却存在明显的差异，它们对不同肿瘤的疗效明显不同。长春花中含有非常多的其他生物碱在临床医疗中也得到了广泛的应用，如阿玛碱和蛇根碱由于它们具有降压作用而作为高效降压药于临床上使用；文多灵、环氧长春碱和长春质碱由于它们具有降低血糖的功效，被广泛用于治疗糖尿病等；文多灵和长春质碱则是非常著名的生物碱类降血脂药物[6]。
长春花生物碱虽然极为重要的药用植物，但是在长春花植株体内含量极其微小，因而长春花的组织培养便被认为很有可能的替代途径而进行开发和研究，60年代就有人开始用组织培养生产长春花生物碱，但效果并不理想，至今只达到中试水平，而且只能生产可用于降血压和镇痛的阿吗碱、蛇根碱或长春质碱，而不能生产长春碱和长春新碱，但是经过不懈地努力，目前每年可以从植物中提取长春碱12t和长春新碱1埏，远不足以满足市场对生物碱的需求，为了更有效地生产长春花生物碱，科学家们尽了很大的努力研究长春花植株细胞内生物碱的生物合成途径，基因的表达与调控，并已取得很大进展[7]。但是到目前为止长春花吲哚生物碱的低产问题仍未得到很好解决。
近年来，模式植物长春花TIAS的次生代谢产物的合成途径研究已经取得较大进展。分为上游、中游和下游三个阶段。上游是莽草酸途径和甲基赤藓醇磷酸盐途径汇合形成异胡豆苷，即来自莽草酸途径的色胺(trytamine)和甲羟戊酸途径的裂环马钱子苷(secolog anin),在异胡豆苷合成酶(STR)催化下形成异胡豆苷(strictosidine)。色氨酸脱羧酶(TDC)催化色氨酸(try tophan)形成色胺,裂环马钱子苷由异戊烯基二磷酸(IPP)衍生而来。在IPP存在情况下,吲哚生物碱主要是通过甲基赤藓醇磷酸盐(MEP)途径在质体中合成[8]。中游是从异胡豆苷到文朵灵碱和长春质碱，即异胡豆苷通过多步羟基化和甲基化,并经中间体水甘草碱(tabersonine)生成文朵灵、长春质碱、阿吗碱等[9]。下游是由文多灵和长春质碱到双吲哚生物碱二聚体，即alpha;-3,4脱水长碱合成酶催化文朵灵和长春质碱形成alpha;-3,4脱水长碱(AVLB),然后再衍生出长春碱、长春新碱等双吲哚生物碱二聚体。属于植物过氧化物酶超家族的AVLB合成酶存在于叶肉细胞液泡膜上。尽管该过氧化物酶有着广泛底物,却局限在液泡,AVLB也仅在叶中大量积累。文朵灵与长春质碱相比,该酶对前者的亲和力更高,长春质碱的存在只是加速该反应的进行,而且在有长春质碱的情况下文朵灵只被用来合成AVLB,这表明通向长春碱的途径中,文朵灵的合成是一个重要的限制因素。液泡膜上转运文朵灵与长春质碱载体的存在决定着AVLB作用于文朵灵与长春质碱这两种底物,而且其附近存在NADPH依赖的氧化酶,产生H2O2,偶联着该过氧化物酶的迅速氧化作用,因此文朵灵与长春质碱在该过氧化物酶的作用下形成AVLB[10]。
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