金属-β-内酰胺酶VIM-2的表达纯化及活性测定文献综述

 2023-01-28 09:01

开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)

1. 研究意义

细菌耐药性问题已经成为临床上抗菌药物治疗面临的最棘手的挑战之一。尽管青霉素、头孢菌素等beta;-内酰胺类抗生素以其显著的疗效、良好的安全性一直占据抗菌化疗使用量的榜首,至今在发达国家中仍占抗菌药物用量的30~40%以上,但这类药物在临床上所遇到的抗药性问题,也无疑是最为严峻的。beta;-内酰胺类抗生素是目前临床应用较广、用量较大的一类抗细菌微生物药物, 自1940年青霉素应用于临床以来, 其在控制与治疗疾病方面发挥着重要作用。目前临床上使用的抗细菌微生物药物品种众多,但随着抗生素的大量而广泛使用, 特别是在临床上的不合理应用, 甚至滥用, 最终导致耐药菌的大量产生。原因之一是细菌产生的能水解beta;-内酰胺环而使抗生素失活的beta;-内酰胺酶。根据beta;-内酰胺酶分子结构氨基酸的不同,在分类学上,将该酶分为A,B,C,D 四类,其中B类活性中心为1~2个金属离子(通常为Zn2 ),且必须依赖金属离子才能发挥催化作用,所以称此类为金属beta;-内酰胺酶(metallo-beta-lactamases,MBLs),其活性可被离子螯合物EDTA、菲咯啉以及巯基化合物所抑制,但不被克拉维酸、舒巴坦等常见的beta;-内酰胺酶抑制剂抑制。目前,已发现的MBLs 还有NDM,VIM,IMP,BcⅡ,CcrA,BlaB,IND,CphA,L-1 和SPM 等。根据MBLs序列的不同又将其分为B1,B2,B3 三类,VIM 属于B1 类。

目前,就细菌的耐药机制而言,有以下几种:⑴产生beta;-内酰胺酶,灭活beta;-内酰胺类抗生素而使其失效;⑵细菌具有外膜屏障(低通透性),这被认为是某些细菌的固有耐药性;⑶主动外排泵(能量依赖),某些细菌具有主动外排泵,可以抗菌药物为底物将药物泵至菌体之外,如:多重耐药株的抗生素排出系统;⑷药物靶点改变,细菌靶蛋白降低了与抗生素的亲和力,使抗生素不能与其结合,从而不能发挥杀菌作用;⑸整合子,最小的能够介导抗生素耐药的可移动基因实体是整合子所携带的基因盒,尤其是Ⅰ类整合子。这些基因盒能够介导对甲氧苄啶、氯霉素、beta;-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类和最近发现的磷霉素、喹诺酮类抗菌药物,主要通过整合子捕获外来基因获得耐药性。

虽然VIM 型MBLs 在氨基酸序列上与其他MBLs 存在差异,但折叠方式与其他MBLs 一样,形成alpha;beta;beta;alpha; 的夹心结构。迄今为止,在已发现的27 种VIM 亚型中得到了3 种亚型的晶体结构,即:VIM-2,VIM-4,VIM-7。VIM-2 晶体结构是由Garcia-Saez MI 等2008年报道通过X-射线晶体衍射所得,由于Cys221 在结晶过程中很容易氧化成Oys221 而形成了氧化型和还原型2 种结构(PDB ID 和分辨率分别为1 KO20.22 nm,1 KO3 0.191 nm),还原型的VIM-2 结构中间有11 个beta;-折叠,外周围绕着5 个alpha;-螺旋,活性中心有 2 个 Zn2( 氧化型的 VIM-2 中只有 1 个 Zn2 位于组氨酸结合位点),分别位于组氨酸和半胱氨酸结合位点,2 个Zn2 相距0.42 nm,在距第2 个Zn2 0.293 nm 处发现有1 个Cl-。Tyr67紧邻60-66残基形成的环形区,其CE2与His263的环上原子形成范得华力而使其稳定。对结构的活性位点进一步进行静电表面分析发现Arg228和Tyr67形成1个正电荷深腔,所以在抑制剂设计时可考虑与此部分形成静电作用。VIM-2与美罗培南有很好的亲和力,可能就是由于美罗培南的哌嗪环与此深腔结合。

VIM 是Verona integron-encoded的缩写,因2009年新报道的新德里beta;-内酰胺酶(NDM-1)与VIM-1,VIM-2序列相似度最高(氨基酸一致性为32%)而再次被广泛关注。VIM 金属beta;-内酰胺酶是1 种能水解几乎所有(除氨曲南等单环外)的beta;-内酰胺类抗生素,也是已报道蛋白质中与新德里金属beta;-内酰胺酶(NDM-1)序列相似性最高的一类获得性金属beta;-内酰胺酶。VIM型基因易于在细菌间传播和扩散,迄今还未发现临床有效的抑制剂,所以研发新型有效的抑制剂迫在眉睫。经典的beta;-内酰胺酶抑制剂(克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦)与beta;-内酰胺抗菌药物的联合使用(如:阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦等)是目前抵抗由beta;-内酰胺酶介导的细菌耐药最为有效的策略,但这些抑制剂仅对A,C,D 类beta;-内酰胺酶有效,至今尚未发现临床上有效的MBLs 抑制剂。本课题涵盖了重组金属beta;-内酰胺酶VIM-2的表达、纯化,并研究VIM-2酶活测定的最适条件,测定酶活,属于对金属beta;-内酰胺酶的基础研究,希望能够对于临床上beta;-内酰胺酶抑制剂提供实验依据。

2.拟研究的问题

1)酶的表达及纯化:pET-28a-VIM-2重组菌的诱导表达并分离纯化。

2)酶的活性测定:研究使用底物,基于水解后底物光吸收的变化建立酶活性测定方法

3.拟采取的研究方案

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