1. 前言
1.1 研究背景
伴随着世界人口的快速增长，能源与环境问题制约着人类文明的发展。发现运用可持续再生的生物质能源成为了人们关注的焦点。其中，生物质资源与化石燃料不同，地球上的绿色植物可以提供大量的生物质资源，其中纤维素是自然界中含量最丰富的碳水化合物[1]，是最廉价的可再生资源。纤维素的基本结构单位是纤维二糖，由D-葡萄糖分子以 beta;-1,4-糖苷键组成的大分子多糖[2]。 因为纤维素有结构简单、含量丰富且具有可生物降解性的特点，倘若能通过生物转化技术把地球上的纤维素和半纤维素全部转化成单糖，将对于解决工农业原料、能源危机、环境污染等问题具有十分重要的意义。
纤维素酶在转化纤维素和半纤维素方面起着决定性的作用。自然界中有不少能生产纤维素酶的微生物，但是大多数的微生物产纤维素酶效率低下，纤维素酶热稳定性差以及寿命短，极大地限制了纤维素酶的推广应用。在这些微生物中，里氏木霉的产酶有产量高、安全无毒性的特点成为主要的纤维素酶生产菌株之一。因此研究纤维素酶的作用机制以及制取具有重大的意义。近年来，人类通过基因工程、原生质体融合、诱变选育等菌种选育方法，在纤维素酶的生产方面取得了较为突出的进展[3]。
1.2 国内外研究现状
里氏木霉产生的纤维素酶广泛应用于食品、饲料和制药等行业。在日本，很多的真菌产纤维素酶的工艺很早就开始大规模商业化生产。在食品行业中，纤维素酶制剂广泛应用于多种提取过程，还应用于烘烤[4]、研磨[5]、酿造[6]和酿酒[7]上。在饲料工业中，纤维素酶产品可用于提高饲料的可消化率[8]。制药工业中，纤维素酶能改善人体肠道蠕动，有助于消化[8]。纤维素酶还在木料加工[9]和纺织方面[9]都有应用。目前并没有资料显示里氏木霉对人体有害，在用一些哺乳类动物中进行致病性研究后，得到的数据显示里氏木霉并是没有致病性的。只有在极端条件下，对免疫力受到抑制的动物接种大量的孢子，这种微生物才会成为病原体。生活中某些霉菌的孢子能够引起过敏反应，与这些霉菌相比，里氏木霉就不会引起过敏反应，同时也不需要进行特别的卫生安全防护措施，里氏木霉还是相对安全的。
虽然很早之前就已经对产纤维素酶采取了真菌研究，但由真菌合成纤维素酶的活性不高，这极大地限制了纤维素酶在工业化生产中的广泛应用。而关于纤维素酶的研究主要集中在微生物分离、选育、产酶条件优化以及一些已知纤维素酶基因的克隆和异源表达上，在以后的研究中，充分运用分子生物学技术，对各种纤维素酶合成过程所涉及的基因及其调控因子的调控模式进行探索，将有助于在分子水平上揭示纤维素酶表达调控的机理[10]。在调控机理的指导下，可以有目的地设计纤维素酶的高效表达诱导物 ；另一方面通过科学家对基因组数据的分析，构建更适于工业应用的里氏木霉工程菌变得更有可能。通过基因调控阻断纤维素酶表达的阻遏途径，同时调控转录激活因子等上游调控元件以增强纤维素酶启动子的启动能力，从而提高纤维素酶表达量和酶活，以满足其在工业中的应用。
我国纤维素酶的研究开始于20世纪 60年代初，几十年来，北京、上海、成都、无锡、广东、山东、沈阳等地的大专院校科研院所进行了纤维素酶的研究工作，选育出一批纤维素酶菌种。如 1968年北京选育出一批纤维素酶菌种；1970年后中国科学院上海植物生理研究所等单位利用诱变方法获得了产酶能力较高的变异株，并进行了生产试验；1975 年广东省微生物研究所分离筛选出纤维素酶产生菌株———长梗木霉；20世纪 90年代中国科学院微生物研究所获得一株突变株康宁木霉 CP88329。20世纪80年代中期上海就生产出纤维素酶。20世纪 90年代初黑龙江省海林市万力达集团公司首条年产2000 t纤维素酶生产线投产，我国成为世界继美国、日本、丹麦之后第 4个能生产纤维素酶的国家[11]。目前，国内关于纤维素酶的特性、作用机理、培养条件、应用试验等方面的报道文献较多。但迄今为止，我国真正形成生产规模的酶制剂只有alpha;-淀粉酶、糖化酶和碱性蛋白酶等3-4个产品，规模生产纤维素酶至今仍未解决，形成不了大批量生产，满足不了市场的需要。因此，丹麦诺和诺德公司的酶制剂产品占领了我国绝大部分市场，使进口纤维素酶的售价昂贵。据统计，我国工业酶制剂销售额只占全世界酶制剂销售额的4 %，而淀粉加工工业用酶却占我国整个酶制剂的 80%以上。这就充分说明，我国纤维素酶制剂工业潜力很大，且亟待大力研究开发新酶种、新用途、新产品。
1.3 立题依据
本实验拟选取硫酸盐处理漂白针叶材纸浆（SBKP）为实验材料，经过预处理后诱导T.reesei产纤维素酶，通过采用分批补料、间歇出酶技术提高纤维素酶酶活。为使所产的纤维素酶便于运输、储存和使用，需要对粗酶液进行浓缩，研究不同的浓缩比例对纤维素酶活的影响。同时通过对酸爆玉米秸秆进行水解实验，比较不同的酶生产方法、不同的浓缩比例对酶水解效果的影响。本实验是对生产的纤维素酶以及通过超滤浓缩的酶液进行酶水解实验，研究不同的酶生产方法、不同的浓缩比例对酶水解效果的影响，最后获得高活力的纤维素酶。
2. 文献综述
2.1 纤维素酶概述
2.1.1 纤维素酶的结构
纤维素酶指的是降解纤维素的一类酶的总称，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系。主要由三种起协同作用的酶：内切beta;-1，4-葡聚糖酶、外切-beta;-1，4-葡聚糖酶和beta;-葡萄糖苷酶组成。在三种酶的共同作用下能把纤维素分子最终降解成葡萄糖[12]。
2.1.1.1 内切-beta;-1，4-葡聚糖酶
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