代谢改造恶臭假单胞菌提高粘酸产量文献综述

 2022-05-01 21:47:21

研究目的及意义

半乳糖二酸是己糖酸，又叫粘酸，是一种重要的平台化合物，可从催化富含D-半乳糖醛酸的生物质中获得。粘酸可以生产己二酸和2,5-呋喃二甲酸（FDCA），己二酸为尼龙的前体，而FDCA被认为具有潜的可再生资源，它有可能代替石油中的对苯二酸。对苯二甲酸用于生产聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET），可用于制造碳酸饮料的瓶子。D-半乳糖醛酸是生产粘酸最理想的产品，其是果胶的主要成分。每年大量的柑橘类水果和甜菜经过加工后的残留物中富含果胶，且目前其残留物在的利用不高。

粘酸可以通过化学法催化D-半乳糖醛酸得到。然而，生物催化D-半乳糖醛酸生产粘酸更为吸引研究者的注意。目前文献中报道恶臭假单胞菌中含有可以将D-半乳糖醛酸氧化至粘酸的糖醛酸脱氢酶UDH，但也同时存在着粘酸脱水酶，从而进一步降解粘酸。在实验室前期已鉴定并分别敲除了假单胞菌中的两个粘酸脱水酶Gard-1、Gard-2的基础上，本实验要首先构建粘酸脱水酶双敲除菌株，在同时敲除两个基因的基础上在假单胞菌中外源表达来源于Agrobacterium tumefaciens Strain C58的糖醛酸脱水酶UDH，考察阻断产物降解途径并过表达产物生产相关酶对粘酸产量的影响。通过相关基因改造来进一步提高粘酸产量并避免采用化学方法带来的污染和浪费。

国内外同类研究现状

D-半乳糖醛酸

2.1.1理化性质

D-半乳糖醛酸是果胶的主要成分，是一种天然含量丰富的化合物，也是一种廉价的原材料，但目前主要用作动物饲料。果胶有潜力成为生物技术转化为燃料或化学品的重要原料。果胶作为食品的凝胶剂、乳化剂与稳定剂，主要取决于分子结构中多聚半乳糖醛酸和甲氧基的含量[1]。果胶存在于一切绿色植物中,在水果及蔬菜等组织中以原果胶、果胶脂酸和果胶酸三种形式存在,通常所说的果胶,即为三者之总称。在植物细胞壁的木质化过程中，果胶能胶能够与木质素生物合成过程的亚甲基醌中间体反应，生成果胶-木质素复合体[2]。果胶分子中除了含有半乳糖醛酸外还含有20%的中性糖组分，是分子量在5万～15万之间的大分子物质，可溶于水而不溶于有机溶剂，其溶解速率与温度、干燥技术、粉粒大小等有关。果胶类型可以分为三种，分别是：同型半乳糖醛酸聚糖 （homogalacturonan，HG），鼠李半乳糖醛酸聚糖I（rhamngalacturonan I，RGI）和鼠李半乳糖醛酸聚糖II（rhamngalacturonan II，RGII）[3]。果胶带负电荷，其分子中部分羧基被甲醇酯化，根据酯化度（DE）的不同，将DE大于50%的称为高酯果胶，小于50%的称为低酯果胶，且酯化度对果胶的凝胶强度和溶解度有很大的影响[4]。

2.1.2 生物代谢

D-半乳糖醛酸分解代谢具有多种微生物代谢途径，这些途径与不同微生物转化为特定的代谢产物有所关联。真核微生物可以利用一种还原途径来代谢D-半乳糖醛酸[5]，在这一途径中，D-半乳糖醛酸首先被NAD(P)H依赖的还原酶还原为L-半乳糖醛酸，在接下来的步骤中，脱水酶、醛缩酶和还原酶将L-半乳糖醛酸转化为丙酮酸和甘油。比如说，D-半乳糖醛酸作为酵母和霉菌生长的唯一碳源以一种不同于原核的途径被使用，经三步酶反应生成丙酮酸和L-甘油醛后，L-甘油酸再在甘油醛还原酶的作用下被还原成丙三醇。

除了真核生物，半乳糖醛酸在原核生物也有特定的分解代谢途径：在大肠杆菌中存在一种异构酶途径[6]，该途径由五种酶组成，在五种酶的共同作用下，分别将D -半乳糖醛酸转化为丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸，同时也产生多种中间代谢产物；在根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中存在着D-半乳糖醛酸的氧化途径，在该途径中半乳糖醛酸可以被氧化成粘酸，除了农杆菌，该氧化途径也被发现于丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）中，在这一途径中,D-半乳糖醛酸被依赖于NADH的D-半乳糖酸脱氢酶氧化为粘酸(mucate)。而一些别的菌株例如霉菌菌株则可以通过外源表达细菌的糖醛酸脱氢酶（UDH）来进行这种氧化，但必须灭活D-半乳糖醛酸分解代谢的内源性途径。UDH是一个NAD连接的热不稳定的、可逆的氧化还原酶（EC1.1.1.203），总分子量约6万，是由两个亚基组成的同型二聚体，最佳pH约为8。

本研究主要立足于假单胞菌对D-半乳糖醛酸进行生物代谢产生粘酸的过程对其菌株进行代谢改造从而优化粘酸产量。

2.2 粘酸

2.2.1 理化性质

现代生物半乳糖二酸(Galactaric acid)是己糖酸，也名粘酸，它的结构式如图所示，是一种具有末端羧酸基团的醛糖二酸，作为在关于D-半乳糖醛酸的细菌氧化分解代谢途径中的代谢物而出现，不仅是一种有机合成原料，可作为护肤品中的添加剂、染料工业上的媒染剂,以及治疗糖尿病的安全助效剂，更是一种重要的平台化合物，可以用化学方法被还原成己二酸或2,5-呋喃二甲酸（FDCA），己二酸为尼龙的前体，而FDCA被认为具有潜的可再生资源，它有可能代替石油中的对苯二酸[7]。粘酸可以从富含D-半乳糖醛酸的生物质中获得, 而D-半乳糖醛酸是果胶中的主要成分。天然出现的半乳糖二酸为D型。半乳糖二酸为白色结晶粉末，熔点215℃,有吸湿性，微溶于冷水，溶于热水，不溶于乙醇，可溶于稀碱溶液[8]。

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