重组人-猪尿酸酶杂合基因工程菌的构建文献综述

 2023-02-02 10:02

1.选题目的意义及国内外进展

1.1研究目的

尿酸酶又称尿酸氧化酶（UricaseUrate Oxidase），在嘌呤代谢途径中有重要作用，大多数哺乳动物发现有此酶的存在。但人类和类人猿体内缺乏尿酸酶不能降解尿酸，如果尿酸浓度增高，易引起高尿酸血症[1-4] 、痛风性关节炎[5]、痛风石沉积及尿酸肾结石形成等症状等疾病。尿酸酶能催化尿酸氧化，生成尿囊素、CO2和 H2O2[6-8]。一系列研究证明，尽管外源性的尿酸酶也能用于治疗尿酸相关疾病，但因其免疫原性高，半衰期短和热稳定性差，其应用受到限制，动物来源的尿酸酶更适于临床应用，因此，探索人尿酸酶失活的原因，有利于使人尿酸酶基因重新得以表达以及尿酸酶在临床应用方面的研究

1.2研究意义

本实验研究意义在于通过将猪尿酸酶的3、5、6外显子替换人的尿酸酶相应的外显子，构建H1-2P3H4P5-6H7-8嵌合体的大肠杆菌BL21工程菌，以期获得尿酸酶的活性并对先前实验室的研究成果进行验证，为人尿酸酶基因失活的原因的阐明给出暗示。

1.3国内外研究现状

早已有研究证明人的尿酸氧化酶基因在第 33 和第 187 氨基酸序列发生了2个无义突变(CGA/AGA→TGA),导致人类丧失了有功能的尿酸氧化酶[9-11]。目前国内外还没有从改变尿酸酶基因结构入手来探索其失活的原因的成功例子。用于治疗人类尿酸类疾病的药物也都是其它来源的尿酸酶,或经PEG等修饰后的尿酸酶，但这些类尿酸酶都存在半衰期短，热稳定性低，免疫原性等某些弊端。

2.研究内容和方案

通过引物的设计，以本实验室先前构建的杂合体H1-4P5-6H7-8、HUOX、PUOX基因为模板使用PCR的方法分别得到H4P5-6H7-8、H1-2、P3三个片段，最后经过OE-PCR将以上三段连起来形成H1-2P3H4P5-6H7-8。进过酶切、酶连，将H1-2P3H4P5-6H7-8基因插入到表达载体pET22b中，最终转化大肠杆菌BL21得到杂合体工程菌。诱导表达以后，经过超生破碎得到粗酶液，使用光谱法测定杂合体尿酸酶活性。

I.PCR法获得目的基因（H代表人的基因片段，P代表猪的基因片段，数字代表外显子）

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