冬生疫霉的检测新靶标的发掘
论文综述
一、课题名称
冬生疫霉的检测新靶标的发掘
二、立论依据
2.1疫霉的发生情况及分布
疫霉属（Phytophthora）此属大多寄生，诱发许多重要的植物病害。疫霉菌的寄主范围很广，可以侵染植物地上和地下部分。为害植物在病斑表面形成类似于腐霉菌的白色棉絮状物或近似于霜霉菌的霜状霉层。致病疫霉（Phytophthora. infestans）引起的病害是农林生产上的严重病害，对农业、园艺、生态等经济体系造成巨大影响。我国已发现的疫霉（Phytophthora）有辣椒疫霉（P.ensp;capsici）、.橡胶疫霉（P.ensp;heveae）、簇囊疫霉（P.ensp;botryosa）、蜜色疫霉（P.ensp;meadii）ensp;、桂氏疫霉（P.ensp;katsurae）ensp;、恶疫霉（P.ensp;cactorum）ensp;等。而在我国进境检疫性名录中的有冬生疫霉（P. hibernalis）、栎树猝死病菌（P. ramorum）、大豆疫霉病菌（P. sojae）、栗疫霉黑水病菌（P. cambivora）、马铃薯疫霉绯腐病菌（P. erythroseptica）、草莓疫霉红心病菌（P. fragariae）、菜豆疫霉病菌（P. phaseoli）等。
2.1.1冬生疫霉（Phytophthora hibernalis）
冬生疫霉（P.hibernalis） 是柑橘类果树生产上的一种重要病原菌，可引起果实褐腐病（brown rot of fruit）枝枯病（tw ig blight）和叶枯病（leafblight）,在果实采收前后造成严重的经济损失[1]。病菌可通过风雨和工具进行近距离传播，远距离传播方式包括带菌土壤、果实和繁殖材料等[2-3]。1925年,首次在澳大利亚西部柑橘果实上发现该病菌[4],随后在欧洲、美洲、亚洲及非洲等多个国家有报道[5]。目前广泛分布于意大利、葡萄牙、法国、希腊、美国、澳大利亚、阿根廷和以色列等国[5]。目前中国尚未有冬生疫霉（P. hibernalis） 分布的报道。在2007年时将其列入我国的进境检疫性有害生物名录。据了解，2013年2－3月，上海出入境检验检疫局还曾连续多次在美国鲜橙中检出丁香疫霉病菌，国家质检总局就此下发通知，从2013年4月18日起，暂停从美国加利福尼亚州进口柑橘。经中美双方磋商和产地考察后，加州柑橘于2014年8月恢复对华出口[6]。
2.2本课题研究的内容、目的及意义
冬生疫霉（Phytophthora hibernalis）引起的疫病是一类植物检疫性病害。该病害的主要寄主为柑橘、苹果、番茄等植物，可引发水果褐腐病、枝枯病和叶枯病，导致果实变褐、腐烂、直至植株死亡。该病菌首次在澳大利亚西部的柑桔果实上发现，目前在欧洲的绝大部分国家，以色列、土耳其、美国加州、澳大利亚、新西兰、巴西等国家和地区均有分布，尤其以意大利、葡萄牙等国柑橘受害严重。目前中国尚无该病菌分布的报道。2015年，上海口岸从进口美国脐橙和柚子中，截获冬生疫霉。疫霉菌特异性新靶标的发掘是病原菌检测技术的关键，本项目拟通过疫霉菌生物信息学研究的方法与工具进行全基因组图谱分析，通过Blast 序列搜索，序列提取、比对与分析，序列数据库建立和管理等多种功能，挖掘大规模的基因组数据库，从而发掘疫霉菌的检测靶标；或通过分析疫霉菌的持家基因的进化关系挖掘更多的保守型的靶标序列。通过对全基因组进行比较分析发现了基因组上基因排布的结构特征：在基因紧密排列并且重复序列较少的区域，基因更加保守；反之，基因密度较少且重复序列较多的区域，基因比较不保守。分子检测靶标要求其序列在种间具有足够多的变异性位点，在种内相对保守。通过对保守区域的基因进行进一步分析从而筛选出高信赖度的核心基因作为疫霉菌的分子检测靶标，进一步基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术的进行冬生疫霉快速可视化检测。
随着我国经济的快速发展，人民生活水平也不断提高， 饮食生活更加丰富多彩。因此进口植物产品的需求量飞速增长，给口岸的植物检疫工作带来了巨大挑战。。目前的植物检疫检测方法工作量大、周期长，步骤复杂，远不能满足国务院于2018年发布的《关于印发优化口岸营商环境促进跨境贸易便利化工作方案的通知》中“对标国际先进水平，提高通关效率，降低通关成本”的要求。重组酶聚合酶扩增技术特异性好、灵敏性好、效率高，而RPA侧流层试纸条易携带和操作，非常适合在实验室环境以外的口岸现场应用。因此本研究拟针对2种易从口岸传入的检疫性疫霉，建立RPA检测技术、开发RPA-LFD试纸条、接种病原菌的样品中应用并进行评价，从而建立检疫性疫霉的快速诊断方法，为今后其他植物疫病快速检测的研究提供参考。
三、文献综述
3.1传统形态学鉴定方法
3.1.1症状观察
冬生疫霉（Phytophthora hibernalis）病菌主要寄主为柑橘（Citrus reticulata Blanco）、苹果（Malus domestica）、番茄（Solanum lycopersicum）等植物，可引发水果褐腐病、枝枯病和叶枯病，导致果实变褐、腐烂。受感染的植株长势衰弱，出现茎枯，叶片褪绿萎蔫，严重时整株死亡。
3.1.2病原菌形态观察
冬生疫霉（Phytophthora hibernalis）菌落白色，花瓣状，边缘不规 则，菌丝紧贴培养基表面生长，气生菌丝较少。在培养基PDA上生长缓慢，菌落为白色花瓣状，边缘不规则，气生菌丝极少[7]。V8 上菌落无色，边缘规则，菌丝紧贴培养 基表面生长，气生菌丝极少。孢子囊卵圆形或椭圆形，易脱落，孢囊柄较长，顶部具有不完全的乳头状突起，通常基部锥形，顶部近半乳突处最宽。孢囊梗不分枝或窄的长分枝，或形成不规则合轴式长侧枝。不产生厚垣孢子，通常无菌丝膨大体。同宗配合，雄器多围生，偶侧生;卵孢子黄橙色，球形[7]。
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