拟南芥液泡膜蛋白质提取文献综述
摘要：植物液泡是植物生长、发育及逆境防御必要细胞器。细胞中有不同类型的液泡, 执行不同的功能, 如蛋白质降解、更新、解毒、代谢物储存和离子稳态等。拟南芥液泡蛋白质组学研究有助于更好地理解液泡转运调控的生理、分子机制，对植物的生长发育具有重要作用。
关键词：拟南芥；膜蛋白；酶解；密度梯度离心
拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 又名属耳芥, 属于双子叶植物纲 (Dicotyledoneae) 白菜花目 (Capparales) 十字花科 (Brassicaceae, Cruciferae) 拟南芥属 (Arabidopsis)。作为国际上首个完成全部基因组序列测定的高等植物, 其优点有: (1) 植株矮小, 为一年生草本植物, 高仅20-30厘米, 占地面积小, 操作简单方便, 有利于在实验室内开展研究工作; (2) 生长周期短, 从萌发到种子成熟仅6周左右, 其时间长短除了受遗传因素影响外, 光、温度、水分、营养、是否杂交等外界条件也会产生影响; (3) 繁殖系数高, 每株可产籽50000粒左右, 种子极小, 有利于各世代各遗传性状的充分表达并开展大量的遗传研究; (4) 自花授粉, 基因高度纯合, 自交亲和, 可建立稳定的遗传品系; (5) 基因组小, 大约有5对染色体和12500万碱基对, 仅次于丝叶狸藻, 在目前已知高等植物基因组中第二小, 适用于分子生物学水平的研究; (6) 具有双子叶植物的所有特性, 细胞经分裂、分化、衰老, 最终走向死亡。
生物膜具有的主要功能可归纳为:能量转换、物质运送、信息识别与传递等, 这些功能在很大程度上决定于膜内所含的蛋白质———膜蛋白。膜蛋白是一类具有独特结构的蛋白质, 镶嵌于膜脂的特性使这一类蛋白处于细胞与外界的交界部位, 介导细胞与外界之间的信号传导, 并执行很多基本的和重要的细胞生物学功能。植物膜蛋白质组学的研究是蛋白质组学研究者关注的焦点之一, 但由于膜蛋白具有低丰度、疏水性等特点, 因此膜蛋白的富集提取、分离鉴定存在很大的难度。在过去几年里, 已开展了一些液泡膜蛋白质的生物化学特性及生理功能的研究。Szponarski等 (2004) 首先报道拟南芥液泡膜蛋白质组研究, 鉴定了70个液泡蛋白质。目前拟南芥液泡蛋白质的研究主要集中在绿色叶片和悬浮细胞, 通过不同类型密度梯度介质富集和纯化液泡或液泡膜微体, 如蔗糖 (Szponarski et al., 2004) 、percoll (Shimaoka et al., 2004) 或Ficoll (Carter et al., 2004;Jaquinod et al., 2007)。
膜蛋白的研究面临的挑战是膜蛋白 (主要是低丰度蛋白、疏水蛋白) 的提取鉴定、膜蛋白的定位和功能等方面。现在一些新技术的利用如增溶剂 (尿素、硫脲) , 新的去垢剂 (CHAPS和ASB-14) , 以及有机溶剂 (CHCl3) 等极大地改善了膜蛋白质的溶解性能;同时一些新的双向电泳技术 (如:自由流电泳) 的利用扩大了膜蛋白的常规分离范围;另外质谱技术的发展使得膜蛋白的鉴定在最近几年取得了较大的发展, 这些技术都在一定程度上使膜蛋白具有低丰度、难溶解、等电点时易沉淀、不易酶解等难题得到一定程度的解决。
现在针对膜蛋白的研究越来越受到重视, 许多植物如拟南芥、烟草等已经成为质膜蛋白质组研究的热点。分析拟南芥、水稻、烟草亚细胞结构的质膜、叶绿体膜、线粒体膜、液泡膜等的蛋白质组, 为植物抗病相关蛋白的研究提供了有利线索。我们计划提取拟南芥液泡膜蛋白质，从液泡蛋白质及液泡膜蛋白的提取、纯化, 到植物液泡蛋白质组及膜蛋白质组的研究, 再到液泡磷酸化蛋白质组研究等各方面进行研究阐述。液泡与细胞质有一层液泡膜, 液泡膜具有特殊的选择透性, 使液泡具有高渗性质, 能调节细胞渗透压和膨压, 并能使多种物质在液泡内贮存和积累。用多相液相色谱或单向SDS-PAGE结合技术成功鉴定了拟南芥营养体的液泡蛋白质, 将分离纯化得到的不同富含液泡膜组分, 经过串联质谱分析共鉴定了402个蛋白质, 其中在12个已知液泡的ATP酶亚基中有11个被鉴定, 还发现4个液泡膜定位的N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体 (SNAREs) , 有证据显示每个有代表性的SNAREs蛋白可能是液泡膜融合所必需的。采用密度梯度离心法提取拟南芥膜蛋白并用二维液相色谱分离纯化液泡膜蛋白组分, 经MALDI-TOF-MS技术分析, 共鉴定了70个液泡膜蛋白质。经生物信息学分析预测, 几乎50%鉴定蛋白是功能未知的, 60%鉴定蛋白质至少有两个跨膜区。
我们的实验与以往不同的是：以往液泡蛋白质分离、富集策略主要有两种:一是制备原生质体, 通过分离原生质体, 渗透压刺激原生质体成功地释放完整的液泡再提取液泡蛋白质样品;二是制备粗的膜提取物, 再从膜提取物中富集液泡膜微体。而我们采用更先进的酶解细胞壁获取液泡、密度梯度离心等方法提取液泡膜蛋白质，使实验结果更精确，更真实。
植物生长发育, 要适应生长阶段的变化, 并且能够抵抗不良环境, 这些过程的分子生物学和生物化学的基础就是蛋白质组。同一生物个体在不同细胞中所含蛋白质的种类和数量不是均一的, 而是动态的, 不断变化的, 即使是同一种细胞, 在不同时期或在不同环境条件下, 其蛋白质组分也在不断地发生着变化。拟南芥的液泡膜蛋白质定位研究积累了大量的数据, 同时所建立和采用的技术策略为相关研究打下了基础。尽管膜蛋白质组研究还处于一个初期阶段, 相关技术手段及其配套应用还很不成熟, 但随着膜蛋白的研究越来越受到重视, 蛋白质研究数据的不断积累, 尤其是针对膜蛋白的提取纯化和分离鉴定的新技术的不断突破和生物信息学工具的日益完善, 膜蛋白在基础研究和农业应用中揭示植物生长发育、抗病机制及代谢调控规律上都将会有所突破。我们希望更加优化的膜蛋白的提取方法、分离鉴定方法被进一步的提出, 相关膜蛋白的数据库也越来越多, 为人类研究膜蛋白提供可靠的保证。
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