开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 研究意义
中国是全球心脑血管病死亡率最高的国家，其中血栓性疾病又是发病率、致残率和死亡率最高的。每年每千人中约有一人发生不同形式的血栓性疾病。其发病机制主要是止血功能改变以致形成凝血块—血栓。20世纪80年代初，通过病理、血管造影和血管显微等技术手段，显示不稳定性心绞痛和急性心肌梗塞，都是由于冠状动脉粥样硬化斑块破裂，使凝血激活，导致血栓形成。引起血栓形成的其他因素还有淤血和高凝等。近年来，我国人口老龄化程度日益加剧，血栓性疾病发病率不断上升，虽然目前可用的抗凝血剂能有效防治血栓性疾病,但各有缺点。传统抗凝血药肝素发挥抗凝作用时需要抗凝血酶III辅助参与，而且只能抑制循环中的凝血酶，能被血液循环中的血浆蛋白所中和，也会引起严重的出血副作用。华法林是一种口服有效的维生素K拮抗剂,但由于遗传多态性、多重药物相互作用等因素,使其产生可变的抗凝反应,需要进行凝血功能监测和频繁调整剂量以确保达到抗凝治疗水平。在此认识基础上,以凝血酶为靶点的新型抗血栓药成为新药开发的一个热点。
水蛭，是地球上比较古老的低等动物，在内陆淡水水域内生长繁殖，是中国传统的特种药用水生动物，其干制品炮制后中医入药，具有治疗中风、高血压、清瘀、闭经、跌打损伤等功效。水蛭有的以哺乳动物的血液为食，有的取食于无脊椎动物的体液、组织甚至整个身体。近年来对水蛭中提取的水蛭素和重组水蛭素的机制研究已很明确，药理研究结果表明，水蛭素是直接凝血酶抑制剂，通过直接作用于血块中和游离的凝血酶，阻止血液凝固，预防血栓形成。但对传统中药水蛭提取物抗凝活性的研究还亟待深入。中药水蛭为水蛭科水蛭Hirudo nipponica Whitman,蚂蝗Whitmania pigra Whitman和柳叶蚂蝗Whitmania acranulata Whitman3种动物的干燥体,是活血逐瘀的常用中药。其中,蚂蝗即非吸血不含水蛭素的宽体金线蛭为我国临床主要应用品种。现代临床应用上，广泛治疗不同系统、病位的血瘀症，适应症涉及心脑血管、肝、肾、血液等疾病以及外伤疼痛、癌症等。国内对宽体金线蛭的报道主要为人工养殖、化学成分研究、影响因素研究等方面，而对其活性成分的研究虽有报道，但其组分多有差异。特别是宽体金线蛭中抗凝物质的理化性质和氨基酸序列不清楚，至今未见详细报道。水蛭的化学成分可分为两大类，一类为多肽蛋白等大分子物质，一类为小分子物质。为了进一步探讨其抗凝血酶的物质及分类，本实验采用宽体金线蛭作为实验材料，对其含有的抗凝血活性成分进行分离纯化并探究其机制，为揭示抗凝血机制和药物研发奠定基础。
- 拟研究的问题
（一）宽体金线蛭中凝血酶抑制剂的分离纯化；
（二）凝血酶抑制剂的结构分析；
（三）凝血酶抑制剂的作用机制研究。
3.拟采取的研究方案
我们通过广泛的文献制定了水提法、阴离子交换层析、膜分离和制备型高效液相色谱法相结合的实验方案，并使用比浊法进行抑制凝血酶活性研究，证明了通过分离纯化的得到的小分子多肽具有抗凝血酶的活性。旨在通过对其进行研究的基础上，为新药的开发奠定基础，为中药水蛭中抗凝血酶活性物质的研究积累经验。
(一）宽体金线蛭的分离纯化
水蛭多肽的分离纯化主要分为两个部分，第一是对新鲜的中药水蛭进行粗提取，第二是对中药水蛭的粗提物进行分离纯化。首先我们利用水提法对干体水蛭进行粗提，然后我们依次采用阴离子交换层析、膜分离技术、制备型高效液相色谱对水蛭粗提物进行分离纯化。
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