植物来源糖基转移酶的异源表达与纯化研究文献综述

 2021-11-03 10:11

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1.前言

植物糖基转移酶是植物体内广泛存在的一种可以进行糖基化反应的一种酶。它可以将蛋白质、核酸、寡糖、脂类和小分子等受体修饰上在生物体内具有催化活化性质的糖基，从而改变受体分子的化学稳定性、水溶性、以及受体分子的转运能力和生物活性等。这对于植物的次生代谢和维持体内激素稳态等的生长发育过程具有非常重要的意义。许许多多被糖基化修饰的化合物成为药物成分的主要来源。然而，天然产物中的糖苷类化合物存在含量低、提取难度大、提取产物纯度差等问题，这极大的限制了对于糖苷类化合物药物的研究与应用。同时天然产物存在很多缺点, 包括生物活性较差、生物利用度低、发挥作用的特异性差以及毒副作用大等, 因此需要通过人工的结构修饰来改善天然产物的性质[1]。近年来基因工程技术的发展使得糖基转移酶可以在大肠杆菌中可以进行高效的异源表达，对于糖苷类化合物的生产起到了重要作用。

2.糖基转移酶的分类

随着对糖基转移酶研究的深入，越来越多的糖基转移酶被鉴定出来。 截至目前， 碳水化合物活性酶数据库CAZy(carbohydrate-active enzyme database)中共收录了高达550978个不同生物物种糖基转移酶的氨基酸序列，包括11654个尚未分类的序列。 根据糖基转移酶序列的相似度、催化底物的特异性和催化产物的立体化学结构，CAZy数据库将糖基转移酶分为107个家族(GT1~GT107)[2]， 其中GT1代表着含糖基转移酶数目最多的家族。根据受体分子的糖基化位点分类, 糖基转移酶催化形成OC糖苷键、NC糖苷键、CC糖苷键和SC糖苷键，相应的糖基转移酶分别是O-GT, N-GT, C-GT和S-GT, 目前研究较多的植物糖基转移酶大多为O-GT。

根据糖基转移酶的三维结构的折叠特征，可以将糖基转移酶分为GT-A, GT-B, GT-C和GT-D4种(图1)[3]。其中GT-A是核苷二磷酸转移酶超家族(包括核苷酸转移酶)，其特征是含有保守的DXD(Asp-Xaa- Asp)基序，用于结合GT-A超家族成员催化反应必需的二价金属离子(多数为Mn2 )。GT-A类蛋白空间折叠的特征是含有两个排列紧密的β/α/β结构域，其N端结构域参与核苷酸糖供体的识别，而C端结构域主要与受体底物相互作用[4]。这种由生物学家Rossmann等人[5] 发现的β/α/β结构域被称为Rossmann折叠(Rossmann- folds)。1999年，Charnock和Davies[6]解析了首个GT-A 类折叠的核苷酸二磷酸糖转移酶SpsA(Bacillus subti- lis)的结构(PDB 1QGQ)。


图1.糖基转移酶四种不同折叠方式

除了糖基转移酶之外，GT-B超家族成员还包括参与糖代谢的其他酶，如糖差向异构酶(UDP-GlcNAc 2-epimerase)[7]。GT-B类折叠同样是由两个Rossmann折叠的β/α/β结构域构成，不同的是其N端结构域参与结合糖基受体，而C端结构域则参与结合糖基供体，它们之间的连接不太紧密，两个结构域相互面对，配体的结合与相对取向的构象变化有关[8]，GT-B类折叠的C端结构域具有高度保守的PSPG (putative secondary plant glycosyltransferase)结构模体，该结构域在糖基供体识别和催化过程中发挥重要的作用。另外，与GT-A超家族不同，GT-B超家族的成员催化作用不依赖于二价金属离子[9]，尚无证据证明其催化活性与金属离子结合之间的关联。GT-C超家族由位于内质网或质膜上较大的疏水蛋白组成，包括N端的跨膜区和C端的环状区域，在第一个胞外环中具有被修饰的DXD基序，目前没有证据证明GT-C超家族的DXD基序与GT-A的DXD基序有共同的进化起源。2014年，Zhang等人[10]以1.4 分辨率解析了副血链球菌(Streptococcus parasanguinis) dGT1的未被表征的功能未知的结构域DUF1792的晶体结构(PDB 4PFX)。该结构域采用一种全新的折叠方式，并具有葡萄糖基转移酶的活性，该结构域的催化活性依赖于二价金属离子，最终被命名为GT-D类糖基转移酶折叠。由于该结构域在细菌中高度保守，在真核生物中不存在，因此可以作为新的抗菌靶标进行深入研究。

3.植物糖基转移酶的应用与展望

随着对植物糖基转移酶的结构和生物活性糖苷化合物的深入研究，更多的植物糖基转移酶被应用在代谢工程和基因工程。

乙酰水杨酸(阿司匹林)是一种非阿片类和非甾体类抗炎药物，是应用最早和最广泛的解热镇痛药和抗风湿药。商业化生产的阿司匹林的前体是水杨酸，其主要来源是石油，这导致了无法践行可持续性发展的问题。2016年，Ahmadi等人[11]使用大肠杆菌(Escherichia coli ) 作为异源宿主。构建含有拟南芥糖基转移酶UGT74F1的表达体系，完成了水杨酸2-O-β-D-葡萄糖苷(salicylic acid 2-O-β-D-glucose, SAG)的生物合成，应用代谢工程并改变翻译起始速率以优化水杨酸SA和SAG的生产工艺。然后利用共培养方法进一步促进SA向SAG的完全转化。SAG的生物活性评估证实，RAW264.7巨噬细胞的NO和ROS(reactive oxygen spe-cies)的抗炎特性与阿司匹林相当或更好，同时对细胞生存能力没有不利影响。最终合成了阿司匹林的活性类似物SAG，同时提供了SAG的生物合成途径。

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