开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
在多种不同的给药途径中，口服给药（administering oral medications）是药物疗法中最常采用的给药方式之一。一直以来，口服给药都具有给药简便，吸收快，生物利用度高的优点，而且患者顺应性好，适合儿童和老人服用[1]。然而，制备一种有效的口服药物也面临着极大的挑战，口服药物的药效易受胃肠功能及胃肠内容物的影响，某些药物甚至会对胃肠产生不良刺激作用。因而，药物的溶解度及生物膜通透性成为影响口服药物被胃肠道吸收的主要限制因素之一。为解决药物的溶解度问题，人们也开始致力于合适的药物载体的开发，使得药物发挥作用不再仅仅依靠药物本身的性质，而是通过载体改变药物在体内的分布并将药物输送到靶器官。近年来，纳米脂质载体( nanostructured lipid carriers,NLC )作为一种由固体脂质纳米粒( solid lipid nanoparticles,SLN )发展而来的新型载药系统，受到了研究者越来越多的关注。它被称为第二代脂质纳米粒子，NLC 与 SLN 不同之处在于其内部结构，NLC是在制备过程中向固态脂质中加入与之化学性质差异很大的液态油, 扰乱固体脂质分子之间紧密有序的晶体结构,使纳米粒以结晶缺陷型或无定型结构存在[2-4], 增加了对药物分子的包容性，从而在一定程度上解决SLN在载药量和稳定性方面的不足，且具有与固体脂质纳米粒(SLN)同样的缓控释作用。
然而， NLC由于较小的粒径，粘附性增强，使其易于粘附在肠壁上，所以药物以口服方式给药后，容易被高度黏弹性、附着性的胃肠道黏膜层以不同方式清除，进而使药物跨过胃肠道上皮细胞层的量有不同程度的降低，无法穿透黏膜进入体循环。
由于存在这些屏障的阻碍，当前许多研究者都致力于开发一种可以快速跨越肠道粘液层，并使药物得到控制释放的载体[5]，也就是所谓的“黏膜穿透型纳米粒”。通过对粒子的表面进行适当的修饰而得到的载体，来进一步提高药物的口服生物利用度。主要考虑表面的亲水性和亲脂性、表面电荷和空间特性等对其的影响。一般认为，表面亲脂性越强，吞噬细胞对其吞噬作用也越强，因此应该选择具有亲水性的材料,如聚乙二醇(PEG),使用PEG对其表面加以修饰，赋予脂质体表面以亲水性。形成的PEG-NLC 亲水性长链可与环境水分子相互作用, 在纳米粒表面形成一层水化层, 阻止血浆蛋白与纳米粒相连接,进而降低网状内皮系统的清除速率，延长药物的半衰期；此外,PEG对纳米粒表面修饰可增加粒子间的空间位阻,防止其聚集增大, 提高体系的稳定性[6]。因此，进一步研究PEG修饰脂质纳米载体(NLC) 的制备和体内外研究是十分必要和迫切的。
本课题通过薄膜分散法制备纳米脂质载体，相对于高温乳化-低温固化法对纳米脂质载体中的磷脂造成的高温破坏，乙醇注入法中的有机试剂较多残留和高压匀质法对纳米载体的量需求多的不足，薄膜分散法可以用于实验室小型化研究，防止磷脂氧化并且通过真空泵作用除去有机试剂，越来越受到研究者关注。本课题的处方中包括双亲性材料口服大豆磷脂，固体脂质三月桂酸甘油酯，液态脂质Labrafac CC，通过加入不同比例的硬脂酸聚氢氧酯（S100）。以香豆素-6为荧光标记染料，通过控制超声时间和超声强度，得到表面亲水性的纳米脂质载体。通过ZetaPALS型高分辨率电位分析仪及粒度分析仪考察制剂的粒径，多分散系数以及粒径表面的电位。通过微孔滤膜过滤法测定香豆素-6的包封率；采用动态透析法研究纳米脂质载体在等渗PBS溶液和K-R液中的体外释放行为。通过ZetaPALS型高分辨率电位分析仪及粒度分析仪考察37℃条件下制剂在PBS和K-R液中的稳定性。
目前纳米制剂多是通过经由细胞内吞的作用进入细胞释药或被细胞摄取后再转运至另一侧。纳米制剂本身的材料特性、粒径、 zeta 电位、表面修饰配体特性等都能显著的改变纳米粒的内吞或转运作用。目前关于纳米制剂的内吞做作用主要包括吞噬作用、网格蛋白介导的内吞作用、小窝蛋白介导的内吞作用以及巨胞饮作用。同时纳米制剂的内吞还与不同的细胞密切相关[7]。本实验通过制备一系列表面水化层厚度差异化的纳米脂质载体，考察水化层厚度对纳米脂质载体细胞摄取的影响。
Caco-2细胞系来源于人体结肠腺癌细胞，在一定培养条件下可自发进行上皮样分化并可形成紧密连接，且表面存在大量的细胞微绒毛结构，其形态学、标志酶的功能表达、转运系统的形成以及渗透特征均与小肠上皮细胞类似，因而作为药物在体小肠吸收的一种有效预测工具，被广泛应用于药物结构与吸收的关系、药物及制剂对粘膜毒性的评价、肠腔内pH值对吸收的影响、药物作用等多方面的研究[8]。Caco-2细胞具有三个限制吸收的因素，即不流动水层、细胞间各种连接处(如紧密连接处)和细胞膜，类似于胃肠道的生理屏障作用，因此，Caco-2细胞能在一定程度上反映出NLC等微粒给药系统的在体肠道吸收情况。在细胞实验中，拟采用caco-2细胞作为模型细胞，考察空白纳米脂质载体和载香豆素-6的纳米脂质载体的细胞毒性，确定细胞实验香豆素-6的浓度大小，采用不同的吸收抑制剂，考察不同粒径的脂质纳米粒载体在吸收途径上是否具有显著性不同。通过流式细胞仪考察细胞对制剂摄取随时间和浓度的影响，在此基础上采用transwell半透膜考察不同粒径的NLC在跨膜专用上的差异性。
通过结扎肠囊模型在大鼠的各个肠段包括十二指肠，空肠，回肠注入一定浓度的含香豆素的制剂，经过特定的时间后将肠内制剂清洗，通过冰冻切片和DAPI染色考察制剂在各个肠段的吸收情况。
参考文献
