开题报告
- 实验设计方案与预期目标：
本课题拟在前期研究基础上，采用脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞（RAW264.7）模型，比较葛根汤不同组成药物的抗炎活性，为阐释葛根汤治疗原发性痛经的作用机制积累工作基础。
- 实验设计方案
1.1 葛根汤不同组成药物的抗炎活性比较
RAW264.7细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基中，37℃, 5% CO2温箱静置培养，常规0.25% 胰蛋白酶消化传代，待细胞生长至对数生长期时，弃去培养基，使用新鲜配制培养基将RAW264.7细胞机械吹下，将细胞稀释至50times;104个/mL，透明96孔板每孔100 mu;L，即5万细胞/孔，放置培养箱培养6-14小时。用给药培养基将浓度为1000times;浓度的药稀释至2times;浓度；浓度为1000times;浓度的LPS稀释至2times;浓度（LPS母液1 mg/mL，终浓度1 mu;g/mL,）；DMSO稀释成2times;浓度（即0.2%含量）。用排枪将细胞培养液吸弃，给药组加2times;浓度药液、空白对照组与模型对照组加0.2% DMSO培养液，均为100 mu;L/孔，放至培养箱预孵育1 h。除空白对照组加给药培养基100 mu;L/孔外，其余孔加2times;浓度 LPS溶液100 mu;L/孔。置于培养箱中培养24 h后，根据试剂盒说明书测NO含量。计算NO释放抑制率。
times; 100%
模型组NO释放量 – 给药组NO释放量
NO释放抑制率=
模型组NO释放量 – 空白组NO释放量
2.2葛根汤不同组成药物的细胞毒性实验
RAW264.7细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基中，37℃, 5% CO2温箱静置培养，常规0.25% 胰蛋白酶消化传代，待细胞生长至对数生长期时，弃去培养基，使用新鲜配制培养基将RAW264.7细胞机械吹下，将细胞稀释至50times;104个/mL，透明96孔板每孔100 mu;L，即5万细胞/孔，放置培养箱培养6-14小时。用给药培养基将浓度为1000times;浓度的药稀释至1times;浓度；DMSO稀释成1times;浓度（即0.1%含量）。用排枪将细胞培养液吸弃，给药组加1times;浓度药液、空白对照组加0.1% DMSO培养液，均为100 mu;L/孔，放至培养箱中培养24 h。各组细胞吸弃培养基后加入 MTT混合液（MTT：培养基=1：9，MTT终浓度为0.5 mg/mL），孵育10 min后，将MTT工作液用排枪吸干净，每孔加入150 mu;L DMSO，摇床震荡5min，测定相应的OD值(参比波长650 nm，测定波长570 nm）。
