一、课题背景
细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)在调控细胞周期及RNA转录后修饰中发挥着重要作用。其中细胞周期蛋白依赖性激酶9(CDK9)负责参与组成正性转录延长因子(P-TEFb)，在转录调控过程中起到关键作用，尤其是对于抗凋亡蛋白转录的调控。近年来相关研究发现，CDK9通路中抗凋亡蛋白MYC和Mcl-1的表达与肿瘤细胞的存活与增殖密切相关，这使得CDK9成为癌症治疗的潜在靶点[1]。
- 细胞周期蛋白依懒性激酶9(CDK9)简介
CDK的生物活性与另一个称为细胞周期蛋白的调节蛋白家族密切相关。它们结合在一起形成功能性异二聚体复合物，负责调节各种细胞重要功能，包括增殖、分化、凋亡和DNA损伤修复。虽然CDK水平在整个细胞周期中保持恒定，但细胞周期蛋白的水平根据蛋白质合成和蛋白酶体降解速率而变化，确保CDK在需要之前不会被激活。根据其功能，CDK分为细胞周期CDK(包括CDK1、CDK2、CDK4、CDK6细胞周期CDK在细胞周期进程的同步化中起着重要作用，而转录CDK主要参与转录调节机制。最近，人们认识到转录依赖是各种癌症类型的潜在的脆弱点，从而对转录CDK产生了越来越大的兴趣。作为转录调节的关键激活因子，CDK9引起了药物化学家的特别关注。
CDK9特异性调节基因转录延伸和基因成熟。首次分离CDK9时，因其特征性氨基酸基序(Pro-Ile-Thr-Ala-Leu-Arg-Glu)而被命名为PITALRE。随后，根据对人类免疫缺陷病毒(HIV)的一项研究，CDK9是阳性转录延长因子b (P-TEFb)复合物的重要成分，该复合物磷酸化RNA聚合酶II (RNAPII)的羧基末端结构域(CTD)。许多研究表明，失调的CDK9信号系统突出存在于多种恶性血液病和实体瘤细胞系中，CDK9抑制可导致癌细胞的生长受到抑制，并引发肿瘤细胞凋亡。因此，靶向CDK9是治疗癌症的一种有吸引力的策略，相关抑制剂的数量正在增加。然而，大多数CDK9抑制剂，尤其是临床开发中的抑制剂，结构类型较为单一，治疗效果不理想，缺乏新型高效的CDK9抑制剂。
- 细胞周期蛋白依懒性激酶9(CDK9)的晶体结构
CDK9存在两种亚型：较多的42kDa蛋白亚型(CDK9-42)和较少的55kDa蛋白亚型(CDK9-55)。CDK9-42由372个氨基酸组成，相对分子质量42kD，CDK9具有经典的蛋白激酶折叠(alpha; beta;折叠)，由C-端和N-端激酶域及ATP结合区域组成。ATP结合位点位于C-端和N-端激酶域之间，由高度保守的激活位点残基组成，调节与ATP的结合和磷酸化转移作用，ATP分子的腺嘌呤环通过疏水作用结合于ATP口袋的疏水空腔中，腺嘌呤环上的氨基和氮原子分于ATP口袋铰链区Asp104、Cys106形成氢键作用，而磷酸基团主要与ATP结合口袋Asp167、Lys48、Lys151等形成离子键或氢键作用[2]。
- CDK9生物学功能
在体内，CDK9细胞周期蛋白(包括细胞周期蛋白T1、T2a、T2b和K)复合物的形成和关键Thr186残基的磷酸化是激活CDK9所必需的。此外，据报道，含溴结构域的蛋白4 (BRD4)和CDK7调节CDK9的活性。[3]作为P-TEFb的一部分，CDK9通过RNAPII CTD的磷酸化刺激转录延长，RNAPII CTD由7个氨基酸的串联重复序列组成。[4]为了促进CDK9的转录, CTD需要过度磷酸化，Ser 2和Ser 5分别是CDK9和CDK7的主要磷酸化位点，通过CDK7磷酸化Ser 5激活RNAPII，从而刺激RNA的转录。进入生产延长期的转变是由CDK9细胞周期蛋白复合物对Ser2的磷酸化引起的。[5,6]
从起始前复合物中释放后，RNAPII开始延伸，但由于负延伸因子(NELF)和DRB敏感性诱导因子(DSIF)的作用，在启动子近端区域暂停，这也阻断了新的RNAPII分子的起始。在BRD4的存在下，CDK9细胞周期蛋白T复合物被募集到启动子区域，磷酸化DISF、NELF和磷酸化导致NELF复合物的释放，并将DISF转化为一个积极的因素，导致延长块的去除。然后，核糖核酸聚合酶抑制剂开始转变为延长期，并刺激新的核糖核酸聚合酶抑制剂分子的启动。[7]
CDK9在全局转录的调节中起着重要作用，特别是在细胞凋亡调节因子髓样细胞白血病1(Mcl-1)和下游原癌基因MYC的转录中，MYC参与细胞生长和细胞周期进程，控制肿瘤细胞的增殖和存活。因此，CDK9信号的失调在各种癌细胞中是显著的，包括血液恶性肿瘤和实体瘤。从机理上讲，CDK9抑制阻断了RNAPII-CTD的磷酸化，并诱导MYC和Mcl-1蛋白水平的下调，这在各种血液恶性肿瘤中得到证实，包括成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、和自然杀伤细胞白血病/淋巴瘤。[8],[9]重要的是，最近的研究表明CDK9抑制激活了癌症中表观遗传学沉默的基因,导致肿瘤抑制基因表达的恢复、细胞分化和内源性逆转录病毒基因的激活。所有这些研究表明CDK9是癌症治疗中有前途的治疗靶点。
- CDK9抑制剂简介
目前开发在研的CDK9抑制剂按其母核结构大致可分为如下几类：黄酮类、嘧啶类、吡唑类、吡啶类、苯三嗪类、嘌呤类、其他类。其中一些CDK9抑制剂与CDK9晶体蛋白的结合较为特殊，对实现CDK9选择性抑制具有积极意义[10,11]。
3.1非选择性CDK9抑制剂
