杨树AspAT5表达载体构建及亚细胞定位研究文献综述

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本研究主要目的是克隆杨树AspAT5基因，构建AspAT5表达载体，以模式植物烟草为材料，通过瞬时表达体系中农杆菌渗透法确定AspAT5基因的亚细胞定位。

通过qPCR和酶活性检测法对Fusarium solani （真菌）侵染的转基因烟草中AspAT5基因的表达和酶活进行测定分析，揭示AspAT5在真菌侵染中表达调控规律。阐明AspAT5在植物体内的分子机制，拓展其在植物体内生理功能的研究。

天冬氨酸转氨酶（AspAT）也称谷草转氨酶（GOT，glutamic oxaloacetic transaminase），是一种磷酸吡哆醛蛋白，其活性位点可与辅因子磷酸吡哆醛结合，可逆催化天冬氨酸和alpha;-酮戊二酸，形成谷氨酸和草酰乙酸，最终调节天冬氨酸的合成或分解代谢，在生物体碳氮代谢的调控中起着关键作用（Ireland et al.,1985）。天冬氨酸转氨酶又可与谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、天冬氨酸合成酶这三种酶共同用于将有机氮转化为氮载体Glu和Asp，在植物氮素同化和运输中发挥重要作用。

天冬氨酸转氨酶以多种同工酶形式广泛存在于高等植物中，是植物中研究最为深入的转氨酶之一（Ireland et al.,1985）。目前，天冬氨酸转氨酶研究得比较清楚的模式植物是大豆，已经知道大豆中天冬氨酸转氨酶有5种同工酶Asp1～5（Wadswort et al.,1993）。其中Asp1在黑暗条件下生长的种子中表达，Asp3和Asp4在叶和光照培养条件下的种子中表达，Asp2和Asp5为组成型表达。在另一种模式植物拟南芥为中，通过Northern blot实验证明每个AspAT的mRNA在不同细胞器中含量都不同，但各AspAT同工酶在植物氮代谢中作用相似（Canut et al.,1995）。转基因研究发现，线粒体AspAT（mAspAT）或细胞质AspAT（cAspAT）转化的烟草在叶片中的AspAT活性分别是野生烟草的3倍或3.5倍，并且这两种转化植物的叶片都增加了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的水平，而具有cAspAT的转基因烟草的叶片也增加了mAspAT的表达水平（Sentoku et al.,2000）。虽然对AspAT的生化特性研究已经进行了十几年，并取得一定的进展，但是有关其基因家族不同成员的分子和生理特性的信息很少，特别是林木树种相关的内容（Su et al.，2019）。木本植物杨树是经济树种与观赏植物的重要组成部分,其快繁、改良、育种一直都是研究热点。近年来,功能基因组学以及基因修饰技术的发展更为木本植物的定向培育提供了广阔空间。

本课题组前期利用生物信息学方法对杨树AspAT基因的结构和进化关系进行了分析，确定杨树中AspAT为多基因编码蛋白，基因组中共有10个AspAT编码基因，利用TargetP、PSORT和Protcomp等软件对AspAT基因的亚细胞定位进行了预测，初步推测其中9个基因分别定位在细胞质中、叶绿体中和线粒体中（表1）。

Table 1. List of AspAT candidate genes in Populus

利用MEGA7对杨树及拟南芥等12种植物AspAT构建系统发生树 (图1)；并利用PlantCARE对AspAT基因的启动子进行分析，发现AspAT家族基因启动子上存在很多胁迫响应元件（图2），提示AspAT对植物的生长发育和抵抗逆境胁迫具有重要的生理学功能。

Figure 1. Phylogenetic relationship between Populus and other plant species. Full-length sequences of AspATs from 12 plant species were aligned by ClustalW. An unrooted tree was constructed by MEGA7 using the neighbor-joining method. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) was shown next to the branches. PtAspATs were labeled with red solid diamond. Some AspATs reported previously in Arabidopsis, tobacco, rice, and maize were marked in various colorful shapes. Pt (P.richocarpa), At (A.thaliana), Eucgr (E.grandis), Glyma (G.max), Gorai (G.raimaondii), Medtr (M.truncatula), Nb (N.benthamiana), Os (O.sativa), Pta (P.taeda), Sobic (S.bicolor), Solyc (S.lycopersicum), Zm (Z.mays).

Figure 2. Prediction of the cis-regulatory elements in promoters. Upstream 1500 bp sequences of each genes promoter were analyzed in PlantCARE server. Stress-related cis-regulatory elements were spotted in different colors.

亚细胞定位是查找生物大分子在细胞器具体位置的过程。蛋白质在核糖体中合成后经蛋白质分选信号引导后被转运到特定的细胞器中，部分蛋白质则被分泌到细胞外或细胞质中，只有转运到正确部位的蛋白质才能发挥其正常的作用，而有些同源性很高的蛋白质，如同工酶，在不同的细胞器中则发挥特异的作用。因此亚细胞定位研究是基因功能研究的重要环节，是稳定遗传转化体系构建的关键一步，是基因调控机制探究的起始环节。

随着分子生物学技术的发展，植物蛋白质的亚细胞定位方法可采取多种方法，包括生物信息学预测（张松，2007）、免疫胶体金标记（冯志敏，2006）以及与报告基因融合瞬时表达（李凤敏，2004）等。近年来也有不少研究表明亚细胞定位方法仍是初步研究基因的有效而直接的方法，且可根据基因、植物的多样性、特异性而选择与调整相应合适的亚细胞定位方法。如李志等人以板栗非胚性愈伤组织为植物材料，瞬时转化基因定位（李志，2019），夏春兰等人以松叶猪毛菜培苗为植物材料，通过农杆菌侵染液瞬时转化基因（夏春兰，2020）。都证明了瞬时转化体系适用于外源基因在植物中快速表达。瞬时遗传转化系统为基因功能的原位初步验证提供可靠的手段，也为进一步的植物过表达体系构建提供基础。国外研究者在对小麦AspAT定位中运用了基因染色体定位法，由于AspAT仅以二聚体的形式具有酶活性，用酶谱法定量分析位点上亚基的出现频率来判断酶活性带染色强度的分布，从而进行定位和酶活分析（Marcin et al.,2016;Hart et al.,1976）。目前应用较普遍的是以借助于报告基因表达产物来实现目标蛋白定位的融合报告基因定位法，其中绿色荧光蛋白GFP应用最为广泛。

GFP 是水母( Ae-quorea victoria )体内的天然蛋白，自1994年Chalfie等揭示了该蛋白作为报告蛋白的潜在应用价值。由于GFP作为报告蛋白不需抗体、辅助因子、酶底物等其他成分，也不影响宿主细胞，因而可以鉴定、跟踪带有GFP的细胞，同时可以进行图像分析。自发现其价值以来,已作为报告蛋白在多种植物、动物、微生物细胞中成功表达。目前已有文献结合GFP通过烟草AspAT5的稳定转化观察亚细胞定位，证明其在叶绿体中大量表达，AspAT家族其余基因尚未有实验证明（Kwok et al.,2004）。本研究将瞬时表达技术结合报告基因，可以有效跟踪融合产物在细胞内的运输、亚细胞定位及代谢（于一帆，2014）。

前人研究发现，AspAT是植物体内控制氮（N）在天冬氨酸和谷氨酸之间分配，在所有生物体内N的代谢中起着至关重要的作用 (Torre et al.,2006; Torre et al., 2014)。AspAT参与天冬氨酸代谢的，被公认为植物生长发育过程中N相关代谢物分流（flux）的关键调控基因 (Gaufichon et al.,2016)。此外，AspAT面对不同的生物胁迫，如灰霉病、疫霉病和假单胞菌，和非生物胁迫，如寒冷、干旱、盐、氮胁迫等(Hruz et al.，2008)都有表达差异。对感染Botrytis cinerea和野生型番茄植株的基因芯片分析表明，除了与发病相关的蛋白质和细胞壁增强蛋白外，AspAT表达也上调了 (Asselbergh et al.,2007)。与未处理的植物相比，盐胁迫和干旱胁迫的拟南芥植物在处理10-24h后表现出Asp3转录增加(Seki et al., 2002)。因此，可通过AspAT基因表达对N胁迫响应的研究，阐明AspAT各异构体在植物生长发育中的生物学功能。以上研究都说明了AspAT与植物抗逆性有关，特别是抗病原菌方面的正负调控，目前的研究还很少涉及到此类生物胁迫的分子机制的研究。

近年来，在江苏北部地区，杨树枯萎病大量发生，主要由茄类镰刀菌（Fusarium solani）造成，给人民生活和生态环境带来了巨大负面影响（李伶俐，2009）。目前对该病害的了解仅限于一般的调查和对病原的了解，而病害的侵染过程、发生规律、预测预报、防范方法均不清楚。根据AspAT对非生物胁迫和生物胁迫的响应，以及本课题组前期获得的F.solani 侵染的杨树的转录组测序结果，AspAT很可能与杨树病害，比如枯萎病的发生和防范有关。

参考文献

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资料编号：[260012]

本研究主要目的是克隆杨树AspAT5基因，构建AspAT5表达载体，以模式植物烟草为材料，通过瞬时表达体系中农杆菌渗透法确定AspAT5基因的亚细胞定位。

通过qPCR和酶活性检测法对Fusarium solani （真菌）侵染的转基因烟草中AspAT5基因的表达和酶活进行测定分析，揭示AspAT5在真菌侵染中表达调控规律。阐明AspAT5在植物体内的分子机制，拓展其在植物体内生理功能的研究。

天冬氨酸转氨酶（AspAT）也称谷草转氨酶（GOT，glutamic oxaloacetic transaminase），是一种磷酸吡哆醛蛋白，其活性位点可与辅因子磷酸吡哆醛结合，可逆催化天冬氨酸和alpha;-酮戊二酸，形成谷氨酸和草酰乙酸，最终调节天冬氨酸的合成或分解代谢，在生物体碳氮代谢的调控中起着关键作用（Ireland et al.,1985）。天冬氨酸转氨酶又可与谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、天冬氨酸合成酶这三种酶共同用于将有机氮转化为氮载体Glu和Asp，在植物氮素同化和运输中发挥重要作用。

天冬氨酸转氨酶以多种同工酶形式广泛存在于高等植物中，是植物中研究最为深入的转氨酶之一（Ireland et al.,1985）。目前，天冬氨酸转氨酶研究得比较清楚的模式植物是大豆，已经知道大豆中天冬氨酸转氨酶有5种同工酶Asp1～5（Wadswort et al.,1993）。其中Asp1在黑暗条件下生长的种子中表达，Asp3和Asp4在叶和光照培养条件下的种子中表达，Asp2和Asp5为组成型表达。在另一种模式植物拟南芥为中，通过Northern blot实验证明每个AspAT的mRNA在不同细胞器中含量都不同，但各AspAT同工酶在植物氮代谢中作用相似（Canut et al.,1995）。转基因研究发现，线粒体AspAT（mAspAT）或细胞质AspAT（cAspAT）转化的烟草在叶片中的AspAT活性分别是野生烟草的3倍或3.5倍，并且这两种转化植物的叶片都增加了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的水平，而具有cAspAT的转基因烟草的叶片也增加了mAspAT的表达水平（Sentoku et al.,2000）。虽然对AspAT的生化特性研究已经进行了十几年，并取得一定的进展，但是有关其基因家族不同成员的分子和生理特性的信息很少，特别是林木树种相关的内容（Su et al.，2019）。木本植物杨树是经济树种与观赏植物的重要组成部分,其快繁、改良、育种一直都是研究热点。近年来,功能基因组学以及基因修饰技术的发展更为木本植物的定向培育提供了广阔空间。

本课题组前期利用生物信息学方法对杨树AspAT基因的结构和进化关系进行了分析，确定杨树中AspAT为多基因编码蛋白，基因组中共有10个AspAT编码基因，利用TargetP、PSORT和Protcomp等软件对AspAT基因的亚细胞定位进行了预测，初步推测其中9个基因分别定位在细胞质中、叶绿体中和线粒体中（表1）。

Table 1. List of AspAT candidate genes in Populus

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