基于荧光检测法和比色法的玉米赤霉烯酮快速检测技术的研究文献综述

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文献综述

1. 玉米赤霉烯酮污染概况

玉米赤霉烯酮（ZEN），又称F-2毒素，最早是从有赤霉病的玉米中分离得到的。镰刀菌属中的禾谷镰刀菌和三线镰刀菌、黄色镰孢、木贼镰孢等菌种是其主要的产毒菌菌侏。调查显示，玉米受ZEN污染最严重，其他谷物，如大麦、小麦、大米、小米、高粱^[1]以及一些经谷物加工得到的产品如牲畜饲料、玉米粉也会在一定程度上受到ZEN的污染。作为一种毒素，ZEN在很多方面都体现出了其毒性：它对人体内的蛋白质合成和免疫反应具有抑制作用^[2]；它的雌性激素方面的影响会降低雄性动物的精子质量以及雌性动物的产量^[3]；长期接触会增加得癌症（如乳腺癌）的几率^[4]。为了减少危害，不同国家都对ZEN在食品中的浓度做出了限值。中国在2011年出台的《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中规定，小麦及小麦粉中ZEN的最高浓度不得超过60mu;g/kg；在欧洲，根据欧委会颁布的Commission regulation (EC) No. 1881/2006规定，婴幼儿食用的玉米制品中ZEN的最高浓度不得超过20mu;g/kg。越来越多的国家对于食品中ZEN的浓度要求也越来越严格，因此，许多国家都在寻找快速准确检测这种毒素的方法。

1. 玉米赤霉烯酮的检测方法
   1. 气相色谱法

气相色谱法（GC法）具有良好的分离能力，考虑到ZEN属于极性化合物，因此，在使用GC法检测ZEN前，需要对其进行适当的衍生处理^[5]。Amelin等^[6]在2013年使用QuECHERS的前处理方法对ZEN进行富集纯化，并结合GC-电子俘获检测器，对多种食品，如谷物、肉类中ZEN的浓度进行测定。通过该方法获得的ZEN检出限为50mu;g/kg，相对标准偏差（RSD）小于8%。尽管GC法具有灵敏度高、回收率高的优点，但由于该方法对设备仪器具有较高的要求，所以在实际应用中常常与其他检测方法联合使用。Zhang等^[7]创立了免疫亲和柱（IAC）-GC-质谱检测器（MS）方法用于ZEN的检测，该方法的检出限可达0.5ng/kg，回收率为79.6%-110.7%。GC-MS法的缺点在于使用GC-MS法时需要将样品从液态转变为气态，一些沸点较高、热稳定性较差的样品无法使用该方法进行检测分析。

• 1. 薄层色谱法

美国分析化学家协会 ( AOAC) 于1968年首先提出可将薄层色谱法（TLC法）运用于测定黄曲霉毒素，此后该方法被逐渐应用并拓展到其他霉菌毒素，包括ZEN的检测中^[5]。吴文达等^[8]建立了用于检测玉米粉中ZEN浓度的薄层色谱法，其比移值 (Rf值)约为0.26。考虑到使用TLC法时存在操作复杂、灵敏度差、分离结果差等缺点，科研人员研究出了高效薄层色谱法，对吸附剂的疏水性和亲水性进行调整，并使用更细的改性硅胶和纤维素作为固定相，使正相和反相色谱的组分更好地分离，令色谱的选择性大大提高。Ostry等^[9]使用高效薄层色谱-荧光检测器对谷物中的ZEN进行测定，得到的检出限为10mu;g/kg，回收率为95%。

• 1. 高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC法)具有较强的分离能力且灵敏度高、专属性强，是目前检测食品中ZEN最常用的办法。HPLC法常与其他检测器联用，如荧光检测器（FLD）^[10]、质谱检测器（MS）^[11]，且在对样品进行分析前，需要进行适当的预处理。Figueira等^[12]构建了利用QuECHERS样品前处理技术结合超声辅助提取和超高压液相色谱荧光检测方法，实现了对谷物中的ZEN 进行敏感和高通量定量检测。其他预处理方法还有免疫亲和柱净化、多功能固相萃取^[13]等。

• 1. 免疫化学检测法
     1. 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法(ELISA)是通过抗原和样品底物与抗体之间的竞争性、特异性结合来测定样品中ZEN浓度的免疫分析方法。该方法具有特异性强、灵敏度高、分析时间短等优点，能够实现对含有ZEN的样品的快速检测。ELISA法可以分为直接竞争免疫吸附法和间接竞争免疫吸附法^[14]，前者将抗体固定化而后者则是将抗原固定化，后者则相反。刘刚等^[15]使用间接竞争酶联免疫检测技术构建了能够在常温下检测谷物中ZEN的方法，其检出限为0.3mu;g/kg，线性范围为0.5-10mu;g/kg，回收率为76.7-104.2%。王文珺等^[16]构建了酶联免疫一步法（使抗原、抗体、酶标之间的二抗反应在一步之内完成）对饲料中ZEN的含量进行检测，该方法的检测限为96.2mu;g/kg（猪饲料）、92.7mu;g/kg（牛饲料）、80.5mu;g/kg（玉米渣）和86.7mu;g/kg（麦麸），回收率为79.4%～104.9%。与传统的二步法相比，尽管牺牲了部分灵敏度，但检测时间更短，操作更简单。Huang等^[17]建立了生物素-亲和素扩增酶联免疫吸附法（BA-ELISA），该方法的检出限为0.35ng/mL，线性范围为0.54～7.99ng/mL，值得注意的是，BA-ELISA法的灵敏度较常规ELISA法比提高了6倍。Zhang等^[18]以磁性纳米粒子为基础，构建了新的ELISA法，其线性范围为0.07～2.41ng/mL，检出限为0.04ng/mL。万宇平等^[19]通过ZEN 半抗原合成了抗原，并最终得到了抗ZEN单克隆抗体，并以此为基础，创立了酶联免疫方法，研发了试剂盒，其线性检测范围为5．0～405.0mu;g/L，回收率为74.5～109.9%。

• • 1. 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法(GICA)是结合免疫胶体金技术与层析技术形成的一种快速免疫化学检测方法。GICA法具有无需大型设备、操作简单、结果可肉眼直接观看、监测时间短，仅需几分钟即可得出结果等优点，因此，进行大量样本筛检的时候常选择GICA法。何方洋等^[20]利用竞争抑制免疫层析原理,开发了ZEN胶体金试纸条，并使用该方法对谷物中存在的ZEN进行检测，该试纸条的检测限为100mu;g/kg, 灵敏度为99%, 特异性为94%, 假阴性率为1%, 假阳性率为6%, 检测时间为10 min。李凤旭等^[21]使用GICA法与HPLC法分别对玉米油中残留的ZEN含量进行检测，研究表明这两种方法在95%的置信水平上获得的结果没有显著的差异。Song 等^[22]提出了一种多重测流免疫分析（LFA）检测ZEN的方法，Chen等^[23]对Song的方法进行了改良与优化，最终该方法对ZEN的可视检测限为50mu;g/kg,线性范围为0.42~0.46mu;g/kg，能够满足绝大部分国家的检测需求。

• 1. 生物传感器法
     1. 电化学生物传感器

电化学生物传感器一般将电极作为转化元件，将ZEN抗体或适配体等生物分子作为识别元件，依靠生物成分间的特异性，将识别出的各种理化信号转变成电位、电流、电容或电阻等物理信号，并将其作为特征检测信号输出，从而达到检测样品中ZEN含量的目的。为了降低识别难度，可以使用纳米材料（碳纳米材料、钯纳米材料、金纳米材料、多壁碳纳米材料）或其他途径对电极进行修饰改性，从而放大信号^[24]。

• • 1. 表面增强拉曼散射传感器

表面增强拉曼散射传感器将生物分子作为探测对象或敏感元件，从而研究生物成分之间的相互作用，具有优异的灵敏度以及良好的生物兼容性。Liu等^[29]通过竞争免疫反应，构建了表面增强拉曼散射传感器，该传感器对ZEN的检测范围为 1 ～ 1 000pg/mL，检测限为 1 pg/mL，能够有效、精准的检测样品中ZEN的含量。

• • 1. 荧光生物传感器

荧光生物传感器是通过传感器中的荧光识别元件，以样品加入前后光学信号的改变作为检测信号，实现对目标分析物中所含ZEN的浓度进行分析的一种生物传感器检测方法。Wang等^[30]基于荧光偏振免疫分析法研发了荧光生物传感器，获得了较好的检测效果。Duan等^[31]使用微乳技术封装CdSe/ZnS量子点合成微珠作为荧光探针，使用免疫层析法对ZEN进行检测，该方法的线性范围为 0.125～10 ng/mL。为了降低量子点荧光分析法的错误率，提升其灵敏度，Zhan等^[32]利用过氧化氢酶对过氧化氢的高催化活性，联合过氧化氢对量子点特殊的荧光响应，构建了一种结合荧光生物传感器的酶联免疫吸附法，该方法的线性范围为2.4～1.25ng/mL，检出限为4.1pg/mL。

• • 1. 核酸适配体生物传感器

与抗原和抗体间的特异性结合不同，核酸适配体生物传感器的工作原理是以核苷酸为识别元件，以其与ZEN的特异性结合引起的信号变化对样品中ZEN的含量进行检测。目前，该方法已经较为成熟的运用到伏马毒素和赭曲霉毒素的检测上。Chen等^[33]遴选出适配体5Z₂₈、8Z₃₁和11Z₁与ZEN结合，并建立了以适配体8Z₃₁为基础的检测ZEN的特异捕获-荧光分析法，该方法的线性范围为3.14nmol～31.4mu;mol/L，检出限为785pmol/L。

1. 总结与展望

目前，检测ZEN的常规方法主要有气相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法及其联用技术、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法以及一系列的生物传感器法。不同的方法在检测时间、灵敏度、准确度等方面均有差异。随着科技的发展，最初的气相色谱法和薄层色谱法已逐渐被淘汰，当前最普遍的检测方法为高效液相色谱法，在与其他技术联用后可以满足绝大部分的分析需求。由于高效液相色谱法对仪器和操作要求较高，检测成本较大，近些年，酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法和生物传感器法发展十分迅速，其检测的准确度及灵敏度均在不断提升。

如今ZEN的检测方法的发展趋势大致为：准确化、简易化、快速化、批量化。在保证结果准确的前提下尽可能简化检测操作、缩短检测时间、实现大批量检测，并逐渐提升检测的灵敏度与准确度。各种类型的试剂盒和胶体金检测试纸条正越来越多地被使用，由此可见免疫分析法在ZEN的新型检测方法中比较占优，但这两种产品的开发使用仍未成熟，商品化较为单一，因此还存在较大的提升空间。另外，ZEN具有一系列有毒的隐蔽型衍生产物，如何将这些衍生产物与ZEN同时检测出来也是仍需解决的问题之一。

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资料编号：[246776]

文献综述

1. 玉米赤霉烯酮污染概况

玉米赤霉烯酮（ZEN），又称F-2毒素，最早是从有赤霉病的玉米中分离得到的。镰刀菌属中的禾谷镰刀菌和三线镰刀菌、黄色镰孢、木贼镰孢等菌种是其主要的产毒菌菌侏。调查显示，玉米受ZEN污染最严重，其他谷物，如大麦、小麦、大米、小米、高粱^[1]以及一些经谷物加工得到的产品如牲畜饲料、玉米粉也会在一定程度上受到ZEN的污染。作为一种毒素，ZEN在很多方面都体现出了其毒性：它对人体内的蛋白质合成和免疫反应具有抑制作用^[2]；它的雌性激素方面的影响会降低雄性动物的精子质量以及雌性动物的产量^[3]；长期接触会增加得癌症（如乳腺癌）的几率^[4]。为了减少危害，不同国家都对ZEN在食品中的浓度做出了限值。中国在2011年出台的《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中规定，小麦及小麦粉中ZEN的最高浓度不得超过60mu;g/kg；在欧洲，根据欧委会颁布的Commission regulation (EC) No. 1881/2006规定，婴幼儿食用的玉米制品中ZEN的最高浓度不得超过20mu;g/kg。越来越多的国家对于食品中ZEN的浓度要求也越来越严格，因此，许多国家都在寻找快速准确检测这种毒素的方法。

1. 玉米赤霉烯酮的检测方法
   1. 气相色谱法

气相色谱法（GC法）具有良好的分离能力，考虑到ZEN属于极性化合物，因此，在使用GC法检测ZEN前，需要对其进行适当的衍生处理^[5]。Amelin等^[6]在2013年使用QuECHERS的前处理方法对ZEN进行富集纯化，并结合GC-电子俘获检测器，对多种食品，如谷物、肉类中ZEN的浓度进行测定。通过该方法获得的ZEN检出限为50mu;g/kg，相对标准偏差（RSD）小于8%。尽管GC法具有灵敏度高、回收率高的优点，但由于该方法对设备仪器具有较高的要求，所以在实际应用中常常与其他检测方法联合使用。Zhang等^[7]创立了免疫亲和柱（IAC）-GC-质谱检测器（MS）方法用于ZEN的检测，该方法的检出限可达0.5ng/kg，回收率为79.6%-110.7%。GC-MS法的缺点在于使用GC-MS法时需要将样品从液态转变为气态，一些沸点较高、热稳定性较差的样品无法使用该方法进行检测分析。

• 1. 薄层色谱法

美国分析化学家协会 ( AOAC) 于1968年首先提出可将薄层色谱法（TLC法）运用于测定黄曲霉毒素，此后该方法被逐渐应用并拓展到其他霉菌毒素，包括ZEN的检测中^[5]。吴文达等^[8]建立了用于检测玉米粉中ZEN浓度的薄层色谱法，其比移值 (Rf值)约为0.26。考虑到使用TLC法时存在操作复杂、灵敏度差、分离结果差等缺点，科研人员研究出了高效薄层色谱法，对吸附剂的疏水性和亲水性进行调整，并使用更细的改性硅胶和纤维素作为固定相，使正相和反相色谱的组分更好地分离，令色谱的选择性大大提高。Ostry等^[9]使用高效薄层色谱-荧光检测器对谷物中的ZEN进行测定，得到的检出限为10mu;g/kg，回收率为95%。

• 1. 高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC法)具有较强的分离能力且灵敏度高、专属性强，是目前检测食品中ZEN最常用的办法。HPLC法常与其他检测器联用，如荧光检测器（FLD）^[10]、质谱检测器（MS）^[11]，且在对样品进行分析前，需要进行适当的预处理。Figueira等^[12]构建了利用QuECHERS样品前处理技术结合超声辅助提取和超高压液相色谱荧光检测方法，实现了对谷物中的ZEN 进行敏感和高通量定量检测。其他预处理方法还有免疫亲和柱净化、多功能固相萃取^[13]等。

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