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手性固定相HPLC法测定替格瑞洛片中替格瑞洛异构体含量
替格瑞洛（Ticagrelor）是一类新型环戊基三唑嘧啶类抗血小板聚集药物[1]，是由英国阿斯利康公司研制开发的一种新的治疗急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）的药物[2]，2011年在美国上市[3]，商品名为倍林达。上市后，被众多国际治疗指南推荐用于ACS患者的治疗，包括欧洲心脏病学会（ESC）指南[4]、美国心脏病学会（ACC）指南和美国心脏协会（AHA）指南等。替格瑞洛于2012年11月在我国上市[5]，同年我国《经皮冠状动脉介入治疗（PCI）指南》也将其列为抗血小板治疗药物之一[6]。该药能可逆性地拮抗二磷酸腺苷（ADP）P2Y12受体[7]，通过抑制新血凝块的形成，帮助患者降低动脉粥样化血栓形成事件的发生[8]，无需经肝脏代谢激活即可直接起效[9-10]，其主要代谢产物AR-C124910XX也是很强的P2Y12受体拮抗剂[11]。国际多中心PLATO研究结果显示[12-13]，替格瑞洛弥补了氯吡格雷抗血小板作用起效慢、个体差异性大等不足。
替格瑞洛的化学名为(1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-D]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊-1,2-二醇，分子式为C23H28F2N6O4S，结构见图1[14]。从结构上看替格瑞洛有6个手性中心[15]，理论上有64种手性异构体。从工艺路线[14-15]上来考虑，实际在成品的质量控制中主要需要控制3种异构体：对映异构体杂质A（后简称：杂质A）、非对映异构体杂质B（后简称：杂质B）与非对映异构体杂质C（后简称：杂质C），具体结构见图1。在这3种杂质中杂质C为降解杂质，替格瑞洛在光照条件下会降解产生该杂质，因此在替格瑞洛片辅料的选择、生产工艺过程的优化、包材的选择以及后续的稳定性研究过程中均需要关注该类杂质的变化。
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图1 替格瑞洛及其各异构体结构式
药物对映体多数情况下在体内会呈现出明显的差异，这种差异性主要表现在代谢途径、药理活性以及毒副作用等许多方面，因此建立灵敏度高、专属性好的手性分析方法来对替格瑞洛片异构体含量进行检测，对控制替格瑞洛片的质量具有重要意义。
替格瑞洛与异构体的分离属于手性拆分，手性拆分的方法包括直接结晶拆分法、化学拆分法、动力学拆分法(包括酶拆分法[16])、色谱拆分法以及手性膜拆分法[17]。近年来色谱拆分的方法应用越来越广泛，主要包括液相色谱法[18]、气相色谱法、毛细管电泳色谱法[19]、超临界流体色谱法[20]、薄层色谱法等[21]。
在高效液相色谱法中拆分对映体通常有3种方法：1.利用手性试剂与被拆分物进行衍生化反应变成非对映异构体，从而可被非手性固定相HPLC拆分；2.在流动相中加入手性添加剂，利用非手性固定相HPLC进行拆分；3.利用手性固定相HPLC进行拆分。其中最有效的方法是手性固定相法，于海云等利用手性固定相对焦谷氨酸对映异构体实现分离；赵静等利用手性固定相正相高效液相色谱法拆分了普萘洛尔对映体；韩小茜等利用纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相高效液相色谱法使氟环唑外消旋体得到分离。
拟建立以手性填料色谱柱为固定相，同时测定替格瑞洛片中对映异构体和非对映异构体的正相高效液相色谱法[22]。
在替格瑞洛异构体分离时采用硅胶表面涂布直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)为填充剂的CHIRALPAK IA手性色谱柱，在分离时异构体与手性固定相会反应生成不稳定的复合物，使之在色谱柱的保留时间不同，从而实现分离。
由于采用正相色谱，流动相一般采用非极性溶剂(如正己烷、庚烷等烃类溶剂)加入少量极性调节剂溶剂(如乙酸、三乙胺、三氟乙酸等)形成的混合溶剂，以调节流动相的洗脱强度；同时由于这些调节剂极性较强，进入色谱柱后可立即占据固定相表面的活性位点形成均匀吸附面，从而提高样品的保留重现性，进而使色谱峰形得到改善。所以在替格瑞洛异构体检测时，同时考虑替格瑞洛的分子结构中含有-OH，选择加入乙酸作为调节剂，流动相采用正己烷-甲醇-乙醇-乙酸的混合溶剂系统。其它色谱条件如流速、检测波长、柱温将由实验进行选择。
为了保证检测结果准确、可靠，必须对所采用的分析方法的科学性进行验证，以证明分析方法符合检测的目的和要求。方法验证内容包括方法的专属性、线性、范围、准确度、精密度、检出限、定量限等，根据不同检测目的，参考中国药典中附录中的方法验证指导原则选择相关的内容进行验证。
专属性主要是指有其他成分(杂质、降解物、辅料等)可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。通常通过分析含有加了杂质ccedil;降解产物、有关化学物质或安慰剂成分的样品，将所获分析结果与未加前述成分之样品的测试结果进行比较，两组测试结果之差即专属性。杂质可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质或辅料，考察测试结果是否受干扰；对于杂质测定，也可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质间是否得到分离。
线性指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。线形通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率（Slope）来表示。数据要求：至少需要五个浓度考察线形，需提供相关系数、y截距（是检定的可能偏差）、回归斜率及方差等参数，应列出回归方程数和线性图。
范围指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。
准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。测定回收率R（recovery）的具体方法可采用加样回收试验法来进行测定。加样回收试验已准确测定药物含量P的真实样品 已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。数据要求:规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次。
重复性、中间精密度和重现性精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。
重复性指在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。中间精密度指同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。重现性指不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。
检测限指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量。它是限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可。
定量限指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比(S/N)为10∶1时相应的浓度或注入仪器的量进行确定，也可用仪器所测空白背景响应标准差(SD)的10倍为估计值，再经试验确定方法的实际测定下限。
参考文献
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资料编号：[82691]
手性固定相HPLC法测定替格瑞洛片中替格瑞洛异构体含量
替格瑞洛（Ticagrelor）是一类新型环戊基三唑嘧啶类抗血小板聚集药物[1]，是由英国阿斯利康公司研制开发的一种新的治疗急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）的药物[2]，2011年在美国上市[3]，商品名为倍林达。上市后，被众多国际治疗指南推荐用于ACS患者的治疗，包括欧洲心脏病学会（ESC）指南[4]、美国心脏病学会（ACC）指南和美国心脏协会（AHA）指南等。替格瑞洛于2012年11月在我国上市[5]，同年我国《经皮冠状动脉介入治疗（PCI）指南》也将其列为抗血小板治疗药物之一[6]。该药能可逆性地拮抗二磷酸腺苷（ADP）P2Y12受体[7]，通过抑制新血凝块的形成，帮助患者降低动脉粥样化血栓形成事件的发生[8]，无需经肝脏代谢激活即可直接起效[9-10]，其主要代谢产物AR-C124910XX也是很强的P2Y12受体拮抗剂[11]。国际多中心PLATO研究结果显示[12-13]，替格瑞洛弥补了氯吡格雷抗血小板作用起效慢、个体差异性大等不足。
替格瑞洛的化学名为(1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-D]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊-1,2-二醇，分子式为C23H28F2N6O4S，结构见图1[14]。从结构上看替格瑞洛有6个手性中心[15]，理论上有64种手性异构体。从工艺路线[14-15]上来考虑，实际在成品的质量控制中主要需要控制3种异构体：对映异构体杂质A（后简称：杂质A）、非对映异构体杂质B（后简称：杂质B）与非对映异构体杂质C（后简称：杂质C），具体结构见图1。在这3种杂质中杂质C为降解杂质，替格瑞洛在光照条件下会降解产生该杂质，因此在替格瑞洛片辅料的选择、生产工艺过程的优化、包材的选择以及后续的稳定性研究过程中均需要关注该类杂质的变化。
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