开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一.课题的研究背景、意义和目的
1974年从人尿中提纯出人的表皮生长因子（hEGF），其结构由53个氨基酸组成，分子量6201道尔顿，分子内有6个半胱氨酸组成的二硫键，形成3个分子内环型结构，组成生物活性所必须的受体结合区域[1]。EGF无糖基部位，非常稳定，耐热耐酸，广泛存在于体液和多种腺体中，主要由颌下腺、十二指肠合成，在人体的绝大多数体液中均已发现，在乳汁、尿液、精液中的含量特异性地增高，但在血清中的浓度较低[2]。众多的实验研究表明，EGF可刺激多种细胞的增殖，主要是表皮细胞、内皮细胞。用于角膜损伤、烧烫伤及手术等创面的修复和愈合取得了很好的疗效[3]。
典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子和转录终止子(5AOX1和3AOX1)，它们被多克隆位点(MCS)分开，EGF外源基因可以在此插入并获得高效表达。当整合型载体转化受体时，它的5AOX1和3AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列[4]。
利用表达载体pPIC9K，其中存在卡那抗性基因，允许利用卡那抗性在酵母体内筛选多克隆拷贝，载体其余部分与pPIC9载体完全一样。载体构建过程中，可供使用的单一限制性内切酶位点为SnaB I, EcoR I, Avr II, Not I.它可利用alpha因子分泌信号肽，高效分泌表达蛋白基因。
二.课题研究的主要内容
1.pPIC9K表达载体的构建
2.甲醇诱导毕赤酵母菌株表达hEGF
3.通过SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白纯度并鉴定
三.研究难点
