一、 本课题的研究背景、意义和目的
近年来，肿瘤免疫得到越来越多的关注，肿瘤免疫检查点抑制剂是肿瘤药物治疗的重要方面之一，即通过肿瘤细胞免疫逃逸，调动自身免疫系统功能来消除肿瘤，研究主要集中在CTLA-4，PD-1和PD-L1三个分子上。
程序性死亡受体配体-1 (programmed death-1 ligand-1, PD-L1)，又称B7-H1( B7 homolog 1) 、CD274，属于B7家族，是PD-1的主要配体。PD-L1由290个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白包含胞外段的两个免疫球蛋白恒定区IgC和IgV样结构域，1个跨膜疏水区和1个由30个氨基酸组成的胞内区。PD-L1高表达于多种肿瘤细胞表面，如黑色素瘤、卵巢癌、肺癌、肾透明细胞癌、尿路上皮癌、头颈部鳞癌等[1]。PD-1/PD-L1 结合时，通过发生磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)的磷酸化、蛋白激酶B(PKB)的进一步激活、刺激性T细胞信号通路的活化、葡萄糖代谢以及干扰素的分泌等，导致T细胞活化的下游信号受阻，进而有效抑制CD3/CD28介导的T细胞转录作用，最终抑制T细胞的免疫功能，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用[2]。研究发现，高表达的PD-L1减弱机体自身抗肿瘤的免疫应答，同时肿瘤的免疫微环境上调肿瘤细胞上的PD-L1表达，参与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移、耐药等过程。虽然PD-1/PD-L2 结合的亲和性高于PD-1/PD-L1 结合，但是由于肿瘤细胞PD-L1 的表达多于PD-L2 的表达，所以目前免疫治疗的研究主要为PD-1/PD-L1 的信号通路阻断剂。抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用可以增强体外T细胞应答并介导抗肿瘤活性，因而免疫靶向治疗成为目前研究的热点[3]。
单链抗体（single chain Fv fragment, Sc Fv）是通过基因重组技术由抗体的重链和轻链可变区通过一段10~25个氨基酸的连接肽串联而成的重组蛋白分子，大部分典型结构是由亲水性氨基酸如甘氨酸和丝氨酸组成。单链抗体虽然缺少 Fc 段，但较好地保留抗原结合特异性和亲和活性，分子量小，穿透力强，免疫原性弱，且容易与效应分子相连构建多种功能的抗体分子，是构建重组免疫毒素与双功能抗体的理想元件[4]。
［1］Merelli B，Massi D，Cattaneo L， et al． Targeting the PD1 /PD-L1 axis in melanoma: Biological rationale， clinical challenges and opportunities［J］． Crit Ｒev Oncol Hematol，2014，89( 1) : 140-165.
［2］Cheng X, Veverka V, Radhakrishnan A, et al. Structure and interactions of the human programmed cell death 1 receptor[J]. J Biol Chem, 2013, 288(17): 11771-11785.
［3］Topalian, S. L. et al. Safety, Activity, and Immune Correlates of AntiPD-1 Antibody in Cancer. N Engl J Med 366: 2443-2454.
［4］Sharkey RM, Rossi EA, Chang CH, et al. Improved cancer therapy and molecular imaging with multivalent, multispecific antibodies[J]. Cancer Biother Radiopharm 2010;25:112. [43]Sharkey RM, Rossi EA, Chang CH, et al. Improved cancer therapy and molecular imaging with multivalent, multispecific antibodies[J]. Cancer Biother Radiopharm 2010;25:112.
二、 本课题研究的主要内容
本课题主要从pMD18-T载体中克隆出VH/VL基因，通过重叠延伸PCR(Overlap PCR)连接单VH/VL基因,并将其连接到pET-22b载体中，转化到E.coli.BL21宿主菌中。收集目的蛋白，通过镍柱，超滤等方式纯化后，用细胞ELISA和流式细胞方法对活性进行多方面的检测。
