基于斑马鱼模型的MPTP药物毒性的行为学研究
摘要：帕金森病（Parkinsonrsquo;s Disease）是一种常见的神经退行性的疾病，伴随有黑质致密部的多巴胺的神经元的缺失，在行为学表现为患者动作缓慢，身体失去柔软性，变僵硬等症状，目前针对帕金森并没有有效的根治手段，主要的治疗药物为左旋多巴以及司来吉兰,因此建立相应的疾病动物模型从而深入研究其发病机理具有重要研究价值。利用此研究结果，可以指导帕金森病的早期治疗、预防以及治疗。神经毒素是现今最常用的复制帕金森动物模型的经典工具。神经毒性试剂MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）是在上世纪70年代末至80年代初被发现，它是一种能够引起动物类帕金森病症状和病理的神经毒素。该试剂可以选择性地造成大脑黑质内多巴胺细胞的缺失，这是帕金森病的一个重要病理特征，因此神经毒性试剂MPTP被广泛用于帕金森动物模型的建立，常见相关模型包括斑马鱼、小鼠等。斑马鱼(Zebrafish)是近年来应用越来越广泛的一种模式生物，斑马鱼属脊椎动物，与人类的基因同源性可以高达85%，其信号传导通路基本与人类相似，其生物结构和生理功能也与哺乳动物高度相似，常用于神经生物学方面的研究。除此之外，由于其体外受精且受精后两天通体透明，可以高通量筛选等独特优点都使其在行为学方面的应用也格外丰富。行为学检测是一种比较经济便捷并且有效地的检测方法，行为学实验是在动态与整体的水平上研究生命活动的本质，也是对形态、生理检测的一种必要补充。构建以MPTP处理的斑马鱼实验模型，设置空白对照，以神经毒剂MPTP浓度为自变量，利用斑马鱼行为轨迹跟踪系统观察不同浓度梯度的MPTP对斑马鱼行为的影响（如游动距离）及影响程度，评估MPTP药物在神经方面的毒性药效，可以为后续中药提取物的鉴定提供基础。
关键词：斑马鱼模型； 行为学； MPTP；帕金森病
一、斑马鱼作为模式生物的优点:
斑马鱼是属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样的暗蓝于银色相间的条纹而得名。
模式生物斑马鱼的研究使用正逐渐深入到生命体多个系统（如神经系统、免疫系统、心血管系统等）的发育、功能和疾病（如神经退行性疾病、遗传性心血管疾病等）的研究中。因为斑马鱼独特的优点，已被成功用于建立神经退行性疾病研究模型。目前国内外研究发现，以斑马鱼为疾病模型在中药上的应用主要是集中在中药毒理研究及中药成分活性筛选两方面。而现在越来越多的科学家选择以斑马鱼作为疾病生物模型的原因主要归纳为以下几点：
- 斑马鱼体型小，在实验室环境下也容易饲养，相对于小鼠等哺乳类动物而言，饲养及维护成本相对较低，在研究过程中可以大规模饲养。
- 斑马鱼的胚胎透明且是体外受精发育，非常有利于研究人员借助显微镜观察其完整的发育情况，24小时便产生主要的器官原基，如眼睛、心脏、体节等部位，这些部位在显微镜下都清晰可见，便于研究人员进行化合物的胚胎毒性检测。除此之外，研究人员还可以对鱼卵进行显微注射，以使发育后的每一个细胞都可以获得注射物质为后续试验研究打下基础。
- 斑马鱼发育极快，繁殖能力强，其性成熟的周期短，繁殖周期一般是一周左右，一次产卵可以达到100-200枚左右，这一特征为实验高通量药物筛选提供了相当必要的条件。
- 斑马鱼的基因组与人类的基因组相似度高达85%，尤其是在血管和心脏发育。且它们在基因以及蛋白质结构和功能方面与哺乳类动物也具有极大的同源性，因此可以作为一种动物模型很好地应用于人类疾病、药物毒理、活性药物筛选等研究中。除此之外，鱼类有第三次基因组复制，保留了很多哺乳类动物所没有的基因有对于研究人员来研究基因演化具有重要的意义。同时很多基因在哺乳动物属于致死基因，由于斑马鱼有多个基因拷贝，可以进行一些在其他动物中无法开展的研究。
- 神经毒性试剂MPTP概论及致病机理：
- 甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）是一种人工合成的Heroin中间产物，1982年一美国青年服用了被MPTP污染的药品后，就出现了类似帕金森病的症状，尸检页证实有黑质的损伤，后来引入动物实验，用于帕金森病的造模。帕金森现行的治疗药物主要是左旋多巴以及司来吉兰，这些药物都可以改善MPTP诱导的帕金森症状。MPTP呈高度脂溶性，易透过血脑屏障，进入脑内后在单胺氧化酶B（MAO-B）的作用下，转化为甲基－苯基吡啶离子（MPP ），而MPP 具有强大的毒性作用。其化学结构与DA相似，被DA能神经元主动摄取后，会导致1.抑制线粒体复合物Ⅰ活性，阻断线粒体氧化呼吸链，引起ATP的耗竭；2. 氧自由基生成增加和自由基清除剂谷胱苷肽含量的减少；3. 一氧化氮合酶（NOS）活性增加，使细胞内一氧化氮（NO）含量增加等结果，进而导致DA能神经元变性、死亡。由于斑马鱼独特的优点，研究人员越来越衷于MPTP诱导斑马鱼帕金森模型，通过利用不同浓度的MPTP来研究对斑马鱼行为特征的影响。Lam首先将MPTP应用于斑马鱼幼鱼并观察到其多巴胺元的显著性减少，而其他神经元不受影响。实验中用同一亲本所产的卵进行不同浓度的MPTP对于斑马鱼幼鱼行为学的分析，通常来说，由于每对斑马鱼成鱼每次能产100-200的鱼卵，每个实验组就将至少有20个斑马鱼幼鱼组成，每次实验包括一组对照组很三个不同浓度梯度100mu;g/mL、150mu;g/mL、200mu;g/mL的处理组，最终在同一亲本的实验中在不同浓度的MPTP处理下观测斑马鱼的行为，并最终确定MPTP的最适合浓度为150mu;g/mL。
- 行为学分析
- 行为学分析简介：斑马鱼行为学分析是一种比较简便又有效得分析整合功能额方法，本实验的行为学分析采用Noldus公司的Daniosision系统进行数据采集和分析处理。将经过药物MPTP处理、发育dpf的斑马鱼按每条16条装入九十六孔板中，用系统的红追踪装置拍摄记录1h中斑马鱼的移动距离，观察斑马鱼行为学活跃性。
- 行为学观测时间点的选择：在Sellinen研究中，低浓度（100mu;L）的MPTP处理在5dpf表现为行为活跃，但是在6dpf和7dpf表现行为数据都没有进行统计学分析，但是可以注意到的是行为学检测时间点是至关重要的，这可能是由于在低浓度的MPTP处理下，6dpf和7dpf多巴胺神经元缺失比5dpf更加的严重。因此每次实验会采集5dpf、6dpf和7dpf的行为学数据进行处理分析，不同的行为学测试时间点结合不同浓度的MPTP处理浓度，每次实验会重复三次保证科学性，最终来确定MPTP的不同处理浓度将会经历大量的行为学实验分析。
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资料编号：[281871]
