仿生水凝胶：甲壳素纳米纤维表面脱乙酰化增强机械强度的醌交联反应
摘要： 由于水凝胶的机械性能较差，通常只限用于承重材料。我们之前介绍过在碱性或氯化钙条件下使用甲壳素纳米纤维(ChNFs)制备高强度水凝胶的方法。本项研究受昆虫表皮硬化过程中“醌硬化”的启发，为使用氨基制备醌交联的ChNF基水凝胶提供了新的方法。通过脱乙酰作用增加了甲壳素纳米纤维表面的氨基含量，当在对苯二酚(HQ)/铜(Cu[II])的缓冲溶液中反应时，表面脱乙酰化甲壳素纳米纤维(S-ChNF)水凝胶颜色逐渐变暗。结果表明，由于醌和氨基之间的交联反应，S-ChNF基水凝胶的拉伸强度比ChNF基水凝胶高将近10倍。鉴于甲壳素的天然可持续性和机械强度的提高，这项工作为制造一种仿生的S-ChNF水凝胶提供了可行的途径，并在生物医学工程领域具有潜在的应用。
- 前言
组织工程材料通常需要采用三维(3D)纤维结构支撑，以实现出色的承重特性或其他生物功能(Li, Xiao, and Liu, 2017)。许多柔软的组织，例如皮肤和韧带，由于具有纤维支撑结构，即使具有“软湿”的性质，也具有出色的承重性能。水凝胶具有水合三维聚合物网络，由于具有与生物组织相似的“软湿”性质而引起了人们的极大关注(Li, Maciel, Rodrigues, Shi, and Tomas, 2015; Li, Rodrigues, and Tomas, 2012; Xu and Li, 2018)。根据来源，水凝胶有合成和天然两种类型。全球对利用自然资源具有极大的关注，甲壳素是最丰富的天然氨基多糖，由于其生物相容性和可生物降解性且无毒，被认为是最有前途的材料之一(Zargar, Asghari, and Dashti, 2015; Hong, Yuan, Yang, Zhu, and Lian, 2018; Ifuku and Saimoto, 2012; Wang et al., 2016)。但是，由于水凝胶在普通溶剂（如水，乙醇和其他有机溶剂）中的溶解度低，机械性能差以及制造难度大，其应用受到限制。因此，近几十年来功能性甲壳素水凝胶的开发备受关注(Duan, Huang, Lu, and Zhang, 2018)。例如，甲壳素可溶于NaOH /尿素溶液，离子液体，氯醇/无机酸，强碱溶液和/或饱和氯化钙中，形成再生水凝胶(Chang et al., 2013; Peralta Ramos et al., 2016; Shen et al., 2015; Tamura, Furuike, Nair, and Jayakumar, 2011; Xu et al., 2016)。使用甲壳素纳米纤维可以制备甲壳素水凝胶，因为纳米纤维具有高长宽比并形成三维网络结构的能力(Ifuku and Saimoto, 2012)。据报道，可以通过溶剂交换(Heath, Zhu, and Thielemans, 2013)，透析(Lu et al., 2013)，pH调节(Tsutsumi, Koga, Qi, Saito, and Isogai, 2014)以及晶体变换(Abe, Ifuku, Kawata, and Yano, 2013)等方法制备甲壳素纳米纤维基材料。先前，我们报道了两种简单的方法，分别使用20 wt%的NaOH或温和的氯化钙制备高强度水凝胶。纳米纤维具有高机械强度，高长宽比和形成网络结构的能力(Abe, Iwamoto, and Yano, 2007; Ifuku et al., 2013; Zhao et al., 2015)。与溶解和再生的甲壳素水凝胶相比，甲壳素纳米纤维之间相互交叉和缠结形成的，这些甲壳素纳米纤维基水凝胶具有较高的结晶度和显著提高的抗拉强度。由于纳米纤维网络结构具有较高的机械强度，我们有责任寻找替代方法来制备甲壳素纳米纤维基水凝胶。
在自然界中，甲壳素通常以有序的结晶纳米纤维形式存在，例如在甲壳类和昆虫中，它们充当结构骨架(Pillai,Paul, and Sharma,2009)。昆虫必须通过蜕皮定期更换它的旧表皮，新蜕的皮软且苍白，但很快变硬并且颜色变深(Andersen, 2010)。据报道，在这些“硬化和变黑”过程中，蛋白质和甲壳素通过醌相互交联形成新的角质层(Mun et al., 2015)。“醌”是与各种亲核试剂发生非酶促反应的化合物，醌在自然界中的用途包括使昆虫的表皮硬化或鞣制过程变硬。具体来说，硬化是由于醌或苯环上的氨基共价交联的结果，醌环是苯酚的氧化作用(Yu, Strug, Cafarella, Seaton, and Krantz, 2012 and Yamauchi, Hatanaka, Muro, and Kobayashi, 2009)。这种氧化作用会产生交联键，从而赋予表皮增强的机械性能以及颜色加深。在这项研究中，基于昆虫表皮硬化的知识，我们介绍了使用甲壳素纳米纤维制备醌交联水凝胶的另一种方法。但是，醌交联发生在氨基之间，甲壳素被高度乙酰化，游离氨基比例低，相比之下，壳聚糖适合通过醌交联形成水凝胶，因为它可溶于低浓度的乙酸或碱溶液中，并且含有更多的游离氨基（DA lt;50%）。据报道，通过将干燥的壳聚糖膜浸入酚/氧化剂的中性溶液中，壳聚糖可通过醌交联形成高强度湿膜(Kumara, Bristowa, Smithc, and Paynea, 2000; Zhang, Hassanzadeh, Miyake, Jin, and Rolandi, 2016)。但是，通过这种方法，壳聚糖只能形成交联的湿膜而不能形成水凝胶，首先应将其溶解在乙酸或碱溶液中，通过反复洗涤以进行随后的醌交联，将其浇铸成中性膜。在中性条件下反应。尽管甲壳素由于其高度延伸的氢键半晶体结构而具有较差的溶解性，但通过构建三维网络结构中性条件，它可以被纳米原纤化并形成薄膜(Ifuku and Saimoto, 2012)。因此，为了在满足中性交联条件的同时获得较高的氨基含量，甲壳素被脱乙酰基化得到表面脱乙酰化甲壳素纳米纤维（S-ChNF），同时保持了形成纳米网络的能力。为了模拟昆虫表皮的醌硬化过程，这项工作研究了在中性水相中醌对含氨基甲壳质纳米纤维的无酶交联。我们进一步描述了开发的甲壳素质水凝胶的机械性能和形态特征。我们期望改善这种仿生水凝胶的机械性能，并应用于生物软组织作为承重材料。
- 实验部分
2.1 原料
来自蟹壳的商业alpha;-甲壳质粉末购自Nacalai Tesque, Inc（日本京都），甲壳素的乙酰化度(DA)为96 plusmn; 1%，由元素分析得出的C和N含量计算得出。所有其他化学品，包括对苯二酚(HQ)和Cu[II]盐均为实验室级，无需进一步纯化即可使用。
2.2 表面脱乙酰化甲壳素纳米纤维
90 °C条件下，将甲壳素粉末（30g）在33 wt% NaOH（700mL）中搅拌4小时，以使表面脱乙酰化(Fan, Saito, amp; Isogai, 2010)。随后收集生成的沉淀物，并通过真空过滤用蒸馏水反复洗涤至中性。对于纳米纤丝，将脱乙酰甲壳素湿粉以1 wt%的固体含量悬浮于蒸馏水中，并加入乙酸将pH值调节至3-4，以促进纤丝化。然后将悬浮液两次以1500rpm的速度通过研磨机（MKCA6-3; Maskoo Sangyo Co, Ltd，日本河口市），从零位置开始以-2.5的游隙规进行磨削处理（对应于0.25mm的偏移），该距离被确定为两个磨石之间的轻微接触点(Abe et al., 2007)。这种处理导致悬浮了表面脱乙酰基的甲壳素纳米纤维（S-ChNF），使用相同的条件制备了没有脱乙酰基化的甲壳素纳米纤维（ChNF），不同是没有使用33 wt% NaOH进行碱处理。
2.3 甲壳素纳米纤维基水凝胶的制备
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