重组谷氨酸脱羧酶发酵工艺的优化
摘要：摘要 gamma;-氨基丁酸（gamma;-GABA）是一种非蛋白氨基酸，作为中枢神经系统的主要调节因子。在使用L-谷氨酸作为底物的gamma;-GABA生产中，谷氨酸脱羧酶是最为理想高效的催化物。在本次研究中，我们优化重组了脱羧酶基因，并分别在大肠杆菌DH5alpha;和BL21克隆和表达，提取纯化所得的酶，催化反应，并筛选出反应的最佳条件。其最佳诱导温度为30℃，辅因子吡哆醛盐酸盐最佳浓度为0.05M。
关键词：gamma;-GABA； 谷氨酸脱羧酶； 大肠杆菌； 吡哆醛5-磷酸盐； 盐酸吡哆醛
- 文献综述
gamma;-氨基丁酸是一种四碳非蛋白氨基酸，广泛存在于动物，植物和微生物中。迄今为止，gamma;-GABA已被广泛用于药物和功能性食品。在过去的几年中，gamma;-氨基丁酸也被报道用作生物塑料的新型构建模块。这些信息表明gamma;-GABA是非常有价值的产品。
日本大阪生物环境科学研究所的森下日出旗得到高产GABA的乳酸菌Lactobacillus plantarum ，该乳酸菌在米糠成分的存在下能增强产GABA的能力。1997年，日本学者Hayakawa对8株短乳杆菌进行筛选，发现在5%谷氨酸为底物下，能积累产生10g/L的GABA。2003年，日本学者掘江典子筛选出一株乳酸菌株最高能积累GABA达到35g/L左右。与日本的研究相比，国内的研究起步较晚，发酵水平也存在太多差距。我国江南大学的许建军、江波等对生物发酵生产GABA进行了研究，用乳酸菌或乳酸菌和酵母菌混用作为菌种，以L一谷氨酸钠为转化底物，添加碳源、氮源以及无机盐组成发酵培养基，利用发酵法生物转化制备gamma;-氨基丁酸。发酵后经检测，GABA在发酵液中的质量浓度高达300~500 mg/100mL。另外，江南大学的刘清和浙江工业大学的徐冬云等通过对食品安全级(GRAS)乳酸菌的筛选，得到一株可高产谷氨酸脱羧酶的菌株，并且对该菌株的发酵培养基与发酵条件进行了优化。结果表明:采用优化后的培养基，发酵液中GABA含量可达到3.l0g/L以上。近年来，随着人们对GABA生物活性研究的不断发展，尤其在其营养价值方面己经逐步完善，发达国家中GABA产品的市场规模也逐步的壮大起来。而目前我国的GABA生产水平还有待提高，没有形成完整的市场规模，在实际的开发和生产过程中仍有许多问题需解决和改善。GABA在自然界中分布极其广泛，然而含量较少，因此寻找安全高效的GABA合成方法具有重要的理论意义和实际应用价值。
目前生产gamma;-GABA的方法主要有三种：化学合成法，酶法或全细胞催化法和微生物发酵法。此外，代谢工程已成功引入菌株改良和重建，如近期构建表达谷氨酸合酶，谷氨酸脱羧酶和gamma;-GABA转运蛋白的重组大肠杆菌的实例，然而，发酵产生的gamma;-GABA产量仍然很低。由于剧烈的反应条件，有毒溶剂的使用，副产物形成和安全风险，化学合成gamma;-GABA有其局限性。因此，酶促或全细胞催化被认为是大量生产gamma;-GABA的理想方法。 谷氨酸脱羧酶（GAD）是唯一已知的催化L-谷氨酸转化为gamma;-GABA的酶。迄今为止，已经在原核生物中鉴定了细菌GAD基因，如大肠杆菌，粗糙脉孢菌， 短乳杆菌，植物乳杆菌，乳酸乳球菌和副干酪乳杆菌[12-17]。大肠杆菌由于其简单的反应程序，高催化效率，温和的反应条件，环境相容性和低成本成为热门菌种，基因工程技术使人们有可能生产大量的GAD来研究其化学特性。E.coli系统是蛋白质表达的首选，因为其易操作性，并在受体和载体上累积了大量的知识和图文信息。然而，也存在着一些弊病，在翻译表达时，很可能会产生不溶性蛋白质，或使它作为一个包含体终止进程。为了克服大肠杆菌的不足，采用改良的表达系统，正是如今的研究热点。
二、查阅中外文献资料目录
[1] Li H, Qiu T, Gao D, et al. Medium optimization for production of gamma-aminobutyric acid by lactobacillus brevis NCL912. Amino acids, 2012, 38:1439-1445.
[2] Lu X, Xie C, Gu Z. Optimisation of fermentative parameters for GABA enrichment by Lactococcus lactis. Czech J Food Sci, 2009, 6:433-442.
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
