一、研究背景
1948年，Mandel等人首次报道了人类血液中循环DNA（circulating cell-free DNA, cfDNA）的存在[1]。cfDNA主要存在于人的血浆和血清等体液中，肿瘤患者血液中cfDNA含量显著高于正常人[2]，其含量的增高对恶性肿瘤的诊断、疗效监测等具有临床诊断意义和预后判断价值。此外，肿瘤病人血清或血浆中存在肿瘤起源的循环DNA（circulating tumor DNA, ctDNA），具有体细胞突变、DNA甲基化、拷贝数变异及微卫星改变等肿瘤特异性的基因改变信息，因此ctDNA可作为肿瘤诊断、监测、预后及指导临床个体化给药的工具[3]。由于肿瘤细胞生长迅速，细胞之间的黏合力较低，大量肿瘤细胞会从原发灶或转移灶中自发地掉落或在诊断治疗过程中被动脱落进入血液循环成为循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）。CTC能够真实反应肿瘤负荷，具有发展为转移病变的能力。同时CTC在肿瘤形成早期就在肿瘤部位生长，携带肿瘤众多的特点和信息，因此从肿瘤组织上脱落下来分布在循环血中的CTC，尤其是经过机体免疫系统存活下来的CTC，可以为癌症的早期诊断、肿瘤治疗效果、肿瘤的转移机制研究等提供重要的研究信息。
液体活检（liquid biopsy）主要指血液中循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC）和血浆游离循环肿瘤DNA（Cell-free Circulating Tumor DNA, ctDNA）的检测。CTC是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。ctDNA是由肿瘤细胞释放到血浆中的单链或者双链DNA，携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变。 液体活检给患者提供了一种非侵入性检测，是一种实时无创技术。该技术取样容易、无需手术，对患者创伤小，对肿瘤大小无要求，可以在疾病治疗过程中随时获得，进行实时追踪检测，并且可实时监测不同阶段的病情变化，克服了肿瘤组织不易多次获取的时间上的局限性；与获取得到的部分肿瘤组织相比，ctDNA更能反应肿瘤的整体基因变异情况，因此液体活检亦克服了肿瘤细胞具有异质性的空间上的局限性[4]。单个CTC具有一个细胞的完整遗传信息，没有其它非癌细胞或核酸的干扰，可以对同一患者进行多次循环肿瘤细胞检测，弥补肿瘤组织检测的不足，是促进癌症个体化治疗的有效途径。
二、传统研究cfDNA及CTC的技术
（一）cfDNA的检测与提取
检测：分为以DNA浓度为主的定量检测和以肿瘤基因特异性改变为主的定性检测。定量检测的方法主要有放射免疫法、荧光染料法、核酸凝胶染色法、荧光定量聚合酶链反应（PCR）等。为了获得高质量的荧光定量 PCR 结果需要高质量的 DNA 模板，因此，提取到高质量、纯度好的 cfDNA 对于下游的检测至关重要。
提取：传统方法主要有酚-氯仿-异戊醇法、磁珠法( SIGMA) 、硅胶膜吸附柱法( QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen公司) 等，一些商品化的cfDNA提取试剂盒已得到广泛应用，但由于不同试剂盒提取的原理、技术水平及产品质量不同，其成本也有差异。进口试剂盒价格高、传统的酚-氯仿-异戊醇法提取效率较低。由于cfDNA含量少，且多为小片段DNA分子（大部分cfDNA片段的长度在180-200 bp）等特点，导致其在提取过程中容易丢失，提取难度增大，检验灵敏度较低，限制了其在临床诊断中的应用[5]。
因此，本实验旨在筛选出高效、快捷、成本较低且提取效率高的cfDNA提取试剂盒。
（二）CTC的富集与鉴定
富集：1、基于免疫学的富集方法：应用细胞表面特异性表达的生物标志物，如癌细胞表面高表达的上皮细胞粘附分子（Epithelial Cell Adhesion Molecule，EpCAM），白细胞表面的白细胞共同抗原（Leukocyte Common Antigen，LCA）CD45，通过抗原抗体反应标记细胞从而达到富集癌细胞的作用。与细胞表面抗原结合的抗体通常与芯片或者带有磁性的物质或者设备连接在一起，在外加磁场的作用下，捕获细胞。正向筛选法选择的靶细胞是肿瘤细胞，EpCAM是最常用的正向免疫富集法的标志物[6]。负向筛选法是以非癌细胞为靶细胞，通过获取非癌细胞并把其从外周血中去除从而达到富集癌细胞的目的[7]，以白细胞共同表面抗原CD45为靶标。
