开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
关于《BRD2调节心肌肥大的机制研究》的开题报告
心血管疾病(Cardiovascular Disease, CVD)一直是威胁人类健康的隐藏杀手之一，尽管有许多学者超过半个世纪的不断研究和突破，其死亡率仍超越肿瘤等谈之色变的疾病，成为工业化国家死亡和残疾的最常见原因[1]。而在一系列心血管疾病中，心力衰竭(Heart Failure, HF)以其慢性、不可逆性等特点，长期受到广泛学者的关注。心力衰竭，简称心衰，指心脏的收缩功能和（或）舒张功能发生障碍，无法维持足够的血液灌注以满足器官的需要，临床表现为疲劳、呼吸困难、多器官功能障碍等症状的心脏循环障碍症候群，它往往最终导致患者的早逝[2]。心力衰竭并不是一个独立的疾病，而是心脏疾病发展的终末阶段，是心脏病理性重塑的结果，其过程包括心肌肥厚(cardiac hypertrophy)、间质纤维化(interstitial fibrosis)和炎症通路激活(inflammatory pathway activation)，最终表现为心肌细胞功能障碍和心肌收缩异常[3，4]。几乎所有的心血管疾病最终都会导致心力衰竭的发生。心力衰竭现有的药物治疗方法，如beta;-肾上腺素能受体、肾素-血管紧张素系统的拮抗剂和抑制剂，大多作用于神经激素信号通路。虽然这些治疗方式一定程度上提高了心衰患者的生存率，但其复发率和死亡率仍然相当高[4]。以往的研究告诉我们，仅仅从血流动力学角度看待心衰，是片面且局限的，现今的趋势是从细胞、分子水平入手，研究心衰病理性发展的机制，从而更高效、安全地为心衰的治疗提供科学可行的思路。
正如前文所提，心肌肥厚是心衰发生发展过程中的一个重要环节。心肌肥厚在血流动力学应激的初期具有代偿作用，可使心房、心室壁应力正常化，提高心脏机能[4]。但是，在持久病理性应急情况下，心肌肥大伴随着间质纤维化、收缩功能失调以及基因表达、能量代谢和电生理特征的异常，最终会导致失代偿性的心功能衰竭。因此 , 心肌肥大本身不仅是一代偿性反应，同时也是启动心功能衰竭的一个病理过程[5]。和心衰一样，心肌肥厚过程所涉及的分子机制也是十分复杂的。在过去的近十年的研究中，人们已经清楚地证明了，抑制特定的促肥厚信号效应器，即使面对持续的压力，亦可以发挥心脏保护作用[2]。因此，对心肌肥大的细胞与分子机制的了解寻找有效的心衰治疗机制具有重要的意义。
心肌肥大涉及一系列细胞核内、胞质中以及各细胞器如线粒体的复杂信号通路网络，心
肌可感受到压力超负荷或容量超负荷性应激刺激，使心肌细胞和间质细胞基因表达发生一系列变化[6]。这其中，人们关注较多的是基因方面的调控，在基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达如何发生可遗传的变化？这就牵涉到表观遗传学(Epigenetics)。表观遗传学是用来描述细胞换代过程中可遗传基因调控或转录沉默的一个术语，它是通过染色质的动态可逆变化和组蛋白末端残基的翻译后修饰介导的[7]。
组蛋白乙酰化(Histone acetylation)，作为最早的和研究最深入的组蛋白翻译后修饰(Histone post-translational modifations, PTMs)，已经被证明是控制细胞必要功能的核心环节[8]。而几乎所有已知的组蛋白乙酰转移酶(HAT)相关的转录共激活因子都包含溴蛋白结构域(bromodomain, BRD)，即在许多染色质相关蛋白中均含有的一段约110个氨基酸残基的序列[9]。BRD能够特异性识别组蛋白中乙酰化赖氨酸(Acetylated lysine)的保守蛋白结构域，通过与乙酰化赖氨酸结合促使染色质重塑因子和转录因子等相关蛋白富集于特定的基因转录位点，改变RNA聚合酶Ⅱ的活性，调节基因的转录表达[10]。目前，人体内发现的61种BRD结构域存在于42种蛋白中，人们根据其母蛋白功能的不同，将其划分为8大家族，BET(bromodomain and extra-terminal domain, BET)蛋白家族是BRD蛋白家族的第2类，包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT。有许多研究已经证实，BET家族成员在生物体的发育如精子发生，和疾病进程如HIV病毒感染、炎症及细胞癌变等过程中，都扮演了重要的角色，而抑制BET，在体外实验中可有效抑制心肌细胞肥大，在体内实验中亦能抑制病理性心脏重塑[11]。此外，已证实抑制BET在心力衰竭[12]、急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)[11]、氧化应激介导的相关疾病[13]和肿瘤[14]的治疗中均有一定积极影响。同时，关于BET抑制剂——JQ1的一系列研究，例如它在肿瘤治疗[15]、糖尿病性心肌病[16]、间质纤维化[17]等方面的积极作用，也佐证了这一点。因此，我们有理由相信，BET家族蛋白是这些相关疾病潜在的、具有广阔研究前景的治疗靶点之一。
在BET家族成员中，溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4, BRD4)的相关研究较多。BRD4的各个结构域均可与许多转录调节因子结合，从而调控细胞的增殖、染色质的组装与重组、炎症反应、氧化应激等进程。BRD4的羧基末端结构域(carboxyl terminal domain, CTD)可招募正向转录延长因子b(positive transcription elongation factor b, pTEFb)，激活转录初始应答基因，从而促使原癌基因c-myc、c-jun及人类免疫缺陷病毒HIV-1启动子的转录，并招募更多的活性PTEFb复合物到乙酰化的核染色质附近，促进RNA聚合酶(pol II)的CTD中Ser的磷酸化，促使细胞转录的进行，调控细胞的增殖过程[17]。以往的大多数研究者们着眼于BRD4与癌症发生发展的机制研究，但近年来，已有学者将目光投射到心血管疾病方面，并证实BRD4，以及其他BET家族蛋白，亦可能成为某些心血管疾病治疗的潜在靶标。例如，有研究发现，心肌肥厚过程诱导了内源性BRD4蛋白的表达，在致心肌肥厚因素的刺激下，BRD4被募集到而作用于一系列相关基因，因而对右心室衰竭(right ventricular failure, RV failure)有一定的治疗意义[18]；BRD4能与ANF基因转录起始点(transcriptional start site, TSS)结合，促进CDK9（pTEFb复合物的组成部分之一）对RNA pol II的CTD的磷酸化，刺激RNA pol II对ANF基因的转录延长，在PE的致肥厚刺激下，BRD4含量明显增加，ANF基因的转录活性也随之提高[4]；亦有研究证明，在肥大刺激下，microRNA-9被抑制，其对BRD4的抑制减弱使得BRD4含量增加，BRD4结合于BNP和ANF的超级增强子和起始点上，促进相关基因的转录[19]。
与BRD4同家族的BRD2，原名RING3 (really interesting new gene 3)或Fshrg1 (female sterile homeotic related gene 1)，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，能与细胞核内染色质结合发挥作用[20]。BRD2与BRD4（及BET家族其他蛋白）结构相似，都含有两个在序列上高度保守的、分别处于N端和C端的BRD结构域[21]。BRD2可以选择性地作用于组蛋白H4上乙酰化赖氨酸12，在体外实验中被证明可特异性识别组蛋白乙酰化密码(histone acetylation code)并允许RNA Pol II通过核小体进行转录[22]。它在细胞生长和神经元细胞生成中起重要作用，它可正向调节E2F依赖性的细胞周期进程；BRD2的不足与大脑结构所需的神经元细胞的减少相关，因而也被看做青少年肌阵挛性癫痫(juvenile myoclonic epilepsy, JME)的主要易感性位点[22]。前文已谈到，BET家族的抑制对心肌肥厚有积极作用，而BET家族中的BRD2、BRD3和BRD4在成人心肌细胞中均有表达[4]，亦有研究证明，BRD2和BRD4相互配合来调节染色质上基因的转录[23]。因此，虽然目前有关BRD2与心肌肥厚关系的研究较少，但我们有理由相信，BRD2和BRD4一样，也参与了心肌肥厚的进程。
基于上述原因，本实验意图探究BRD2与心肌肥厚之间的关系，具体将分为三个部分：一、完成SD乳鼠心肌细胞的原代培养，建立ISO诱导的心肌细胞肥大模型，检测心肌肥大模型下BRD2的表达变化（2019.2.20-2019.3.20）。异丙肾上腺素(isoprenaline, ISO)作为beta;受体激动剂，是常用的诱发心肌肥厚和心力衰竭的药物之一。二、干扰或过表达BRD2后，观察对心肌肥大进程有无影响，主要通过检测心肌肥大指标ANF的变化来判断（2019.3.20-2019.6）。心房利钠肽(atrial natriuretic peptide, ANP)一种主要由心房分泌的（心衰较严重时心室亦可分泌）具有舒血管、抑制RAAS系统、抑制交感神经活动、减少水钠潴留等作用的多肽。近来的研究表明，心衰代偿期和失代偿期心肌ANP mRNA的表达均增高，因此ANP可作为判断心衰严重程度的指标[6]，亦可作为心肌肥厚的诊断参考指标。三、准备样品进行RNA sequence的检测（2019.6-2019.7）。预备制备“NC”、“NC ISO”、“siBDR2”、“siBRD2 ISO”、“vector”、“BRD2”六组样品进行检测，寻找与ISO介导的心肌肥大及BRD2均有一定关系的可能基因，为后续探寻BRD2在心肌肥大中的具体机制提供方向和指导。
