开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1、立题背景和意义
酪氨酸酶是一种铜结合蛋白，在其活性位点有两个铜离子，广泛分布于人体、动物、植物和微生物中，又称酚氧化酶、多酚氧化酶。酪氨酸酶兼有单加氧酶和氧化酶双重功能,可以催化L-酪氨酸为多巴醌，然后将其转化为黑色素，是生物体内参与黑色素合成的关键酶[1]。酪氨酸酶在不同的生物中都发挥着很重要的功能，在人体中，酪氨酸酶的过度活跃导致黑色素的过度产生，黑色素积聚在皮肤中，会引起许多皮肤病，例如雀斑，黄褐斑，发炎后的黑皮病，老年斑和黑色素瘤等[2-3]；在植物中，酪氨酸酶是引起果蔬褐变的关键酶；在微生物中，酪氨酸酶代谢产生的黑色素能提高细菌对抗紫外线和其他电离辐射作用[4]。故酪氨酸酶抑制剂在医疗美容、食物保鲜、农业防治等方面有重要作用。
针对这一靶标，目前主要有四类小分子调控剂，1）酪氨酸酶抑制剂：如曲酸，氢醌，4-n-丁基间苯二酚等；2）抑制酪氨酸合成类：壬二酸，维生素A酸等；3）加速酪氨酸酶降解类：亚麻油酸、次亚麻油酸；4）抑制酪氨酸酶糖化类：软骨糖氨，衣霉素等。此外还有直接针对黑色素进行还原（维生素C）、漂泊（双氧水）等化合物。上述化合物中主要以一类化合物的研究和运用最为广泛，但这类化合物须较高的浓度去起到相应的抑制效果，并且部分化合物还存在着致癌的隐患，如曲酸、氢醌等。
本课题将在蛋白水平、基于PROTACs策略设计并合成新型酪氨酸酶小分子调控剂。利用曲酸作为酪氨酸酶配体，泊马度胺及VHL分子作为E3泛素连接酶配体，利用不同的Linker链连接，构成目标化合物。蛋白嵌合分子(protein proteolysis-targeting chimeras, PROTACs)由Deshaies课题组[5]于2001年首次报道，是一种利用泛素minus;蛋白酶体降蛋白质的方法。PROTACs是一种双功能小分子化合物, 其结构一端是泛素连接酶E3配体, 另一端是与细胞中目标靶蛋白结合配体, 两个配体之间通过连接基相连。PROTACs通过将目标靶蛋白和细胞内的E3拉近,形成靶蛋白-PROTACs-E3三元聚合体,通过E3泛素连接酶给目标靶蛋白加上泛素化蛋白标签,启动细胞内强大的泛素化水解过程,利用泛素minus;蛋白酶体途径特异性地降解靶蛋白[6]。基于“事件驱动药物”模型设计的药物相较于传统“占据驱动药物”模型的药物（作用于催化口袋的激酶抑制剂）具有多个优势：1）“事件驱动”小分子可以通过多次循环移除多化学计量比的靶蛋白；2）“事件驱动”小分子作用之后的靶蛋白只能通过再合成途径发挥催化作用，相较于“占据驱动”药物分子存在动力学优势；3）“事件驱动”中小分子配体无需强制占据蛋白催化口袋，其结合于蛋白的任意位点均可诱导蛋白降解[7-8]。
- 研究内容和目的
- 完成2-3个酪氨酸酶调控剂的设计与合成。
- 进行化合物相关的生物活性实验。
- 进行小分子对黑色素的降解的研究并测定相关主要的理化性质，筛选出优良的化合物尝试运用于美白化妆品方面。
- 基于小分子结构和酪氨酸酶结构以及相关实验数据得到有用的构效关系。
- 研究方法
- 在蛋白水平、基于PROTACs策略设计并合成新型酪氨酸酶小分子调控剂。利用曲酸作为酪氨酸酶配体，泊马度胺及VHL分子作为E3泛素连接酶配体，利用不同的Linker链连接，构成目标化合物。
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CCK-8法测定化合物对B16小鼠黑色素瘤细胞活性的影响
当细胞生长至对数期时，消化制成细胞悬液，以每孔体积100uL，密度为5*10个/mL,接种于96孔板中。培养24h,待细胞贴壁之后，用移液枪弃去培养液。实验分空白组：只含培养液；对照组：加培养液正常培养细胞；测试组：每孔加入100pL含不同浓度样品的培养液。测试的样品均设置5个浓度，每个浓度设置3个复孔。培养24h后，每孔直接加入5mu;LCCK-8溶液，于培养箱中继续培养3h后，酶标仪于450nm处测定各孔的吸光度(OD值与活细胞数成正比)。按照公式计算细胞存活率：
细胞存活率(%)=(测试组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值空白组OD值)*100% - 多巴氧化法测定化合物对B16小鼠黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性的影响
细胞培养同上，当细胞生长至对数期时，消化制成细胞悬液，以每孔体积3mL,密度5*10个/ml,搂种于6孔板中。培养24h，弃去培养液，PBS洗涤两次。实验分空白组：加入不含样品的，吸弃培养液，每孔加0.5mlL胰酶细胞消化液进行消化，然后收集细胞至离心管中，100/min，离心5min。离心后弃去上清液，得到细胞团，加入预冷的PBS洗涤，6400r/min，离心5min，离心后弃去上清液，每管中加入70uL裂解液，放置于冰上，充分裂解30min，每10min混匀一次。之后4°C，12000/min，离心15min,收集上清液即为总蛋白，下层细胞沉淀用于黑色素含量的测定。
蛋白定量：将500ug/mL蛋白标准品按照0,1,2,4,8,12,16,20uL加到96孔板中，每孔均加稀释液使其总体积保持在20uL。加适当体积待测蛋白样本到96孔板，每个孔中均加入200uLBCA工作液，37°C孵育30min。于酶标仪测定562nm处的OD值，作出标准曲线，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
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酪氨酸酶相对活性的测定：蛋白定量后，把蛋白祥品均稀释至500ug/mL,每个浓度设置3个复孔，每孔加20uL蛋白稀释液和100uL底物L-多巴溶液，37°C孵育30min,检测475mm处的OD值[9-10]。按如下公式计算细胞中的酪氨酸酶活性：
酪氨酸酶的相对活性(%)=测试组OD值/空白组OD值*100% - Western-Blot实验
- 利用分子对接技术、进行动力学分析研究酪氨酸酶抑制剂的理化性质和作用机理
【参考文献】
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[10]Xuefei Tan,Yeong Hun Song,Chanin Park,Ki-Won Lee,Jeong Yoon Kim,Dae Wook Kim,Kwang Dong Kim,Keun Woo Lee,Marcus J. Curtis-Long,Ki Hun Park. Highly potent tyrosinase inhibitor, neorauflavane from Campylotropis hirtella and inhibitory mechanism with molecular docking[J]. Bioorganic amp; Medicinal Chemistry,2016,24(2).
