开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题背景
肝脏是腹腔内最大的实质性器官，担负人体的解毒，新陈代谢，合成分泌性蛋白质等重要生理功能[1,2]。在临床上，各类肝脏疾病如非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌等的高发另人担忧。这些肝脏疾病的发生有着较为相同的原因，即肝损伤。各种病因所致的肝损伤，包括病毒感染、肝切除、酒精、药物，尤其是新药和联合用药的增多，使得肝损伤逐年增加，并成为严重威胁人类健康的常见疾病之一。肝损伤的结果可致肝细胞死亡, 甚至肝衰竭的发生。临床上肝衰竭的死亡率可达80%[3]。目前具有临床意义的保肝药甚少，且治疗周期长。因此，积极探寻具有抗肝损伤作用的可能性靶点及其作用机制研究对于新药研发具有重要意义。
磷酸化/去磷酸化调节在生物进程中扮演着极其重要的角色，对许多反应起着“开/关”作用。其不仅可以通过构象改变，还可通过电荷效应等来修饰蛋白质的结构与功能。当然，肝损伤中涉及的肝细胞死亡也离不开磷酸化/去磷酸化的修饰调控。不管何种原因引起的肝损伤，肝细胞死亡的表现类型主要包括凋亡（Apoptosis）和坏死（Necrosis）。肝细胞凋亡的信号转导机制十分复杂。目前，认为经典信号通路至少有3 条:死亡受体（Fas、TNFR、TRAIL等）通路，线粒体通路和内质网通路。死亡受体的激活是由于各种外界因素所致的。以Fas为例，Fas是一种肿瘤坏死因子受体家族中的一个成员，本质为一种跨膜蛋白。Fas的活化可分为以下步骤。首先Fas的配体FasL会诱导Fas三聚体化 ,进而细胞膜上形成FasL-Fas-FADD 复合物,其中FADD（Fas-associating protein with a novel death domain) 为凋亡信号传导的一个连接蛋白 ,其C端与Fas分子胞内段结合，N 端随即结合多个未被活化的的半胱氨酸蛋白酶 8( caspase - 8 )酶原，随后Caspase - 8双链聚合，被活化，形成死亡诱导信号复合物。复合物进一步激活caspase-1，3，7等，开启细胞凋亡[4-6]。同时，caspase-8还会切割Bid使其活化后进入线粒体，同时开启内源性凋亡途径。线粒体通路和内质网通路是细胞内源性控制凋亡的途径。在粒体通路的细胞凋亡信号途径其中细胞色素C从线粒体的释放是一个关键调控步骤。释放在胞浆中的细胞色素C会与凋亡相关因子1(Apaf - 1)结合，进而通过caspase-9，caspase-3途径诱导凋亡。目前研究认为在细胞凋亡中线粒体释放细胞色素C是通过线粒体 PT孔及Bcl - 2家族形成的通道所释放的。其中PT孔的调节又受到Bcl - 2家族成员的调控。在内质网通路中非折叠蛋白反应会引起细胞凋亡。主要的分子机制为内质网所释放的蛋白质分子与 Caspase蛋白家族以及其他蛋白如 Bap31、IRE1等结合，形成复合物后作用于线粒体中的Bid，Bim，下游信号通路与线粒体凋亡途径类似[7,8]。由此可见，细胞的凋亡调控过程众多，往往是多通路作用的结果。这3条通路并非完全独立，在很多情况下存在着交互联系。细胞坏死长期被认为是一种不受调控的被动死亡方式，实际上，它也可能是细胞凋亡过度或失控的结果[9]。此外，近些年研究发现，有的细胞坏死是一种程序性坏死（necroptosis）。其中，RIP1/RIP3蛋白能否相互磷酸化在程序性坏死中起枢纽作用[10,11]。以上所提及的信号通路都受到了磷酸化/去磷酸化修饰调控。由此可见，磷酸化/去磷酸化调控的信号通路在肝损伤过程中发挥着重要的作用。研究磷酸化/去磷酸化调控的信号通路在肝损伤中的作用具有重要的基础与临床意义。
MYPT1（myosin phosphatase targeting subunit-1 ）是磷酸酶PP1的调节亚基，呈广泛表达。关于MYPT1的功能研究主要集中在平滑肌收缩相关方面，少量涉及胚胎的发育。MYPT1在肝脏中的功能未曾有过报道。
- 要解决的问题
运用基因敲除小鼠模型，我们发现：肝组织特异性敲除MYPT1导致小鼠胚胎发育时期死亡。以上实验结果表明, MYPT1在小鼠肝脏的发育过程中起到重要的调控作用其缺失可能会引起肝损伤。以上实验结果都提示我们：MYPT1可能具有抗肝损伤的作用。那么，MYPT1是如何调控肝损伤？过去在平滑肌研究中证实MYPT1可以调节PP1的磷酸酶活性，缺失MYPT1，PP1对底物肌球蛋白轻链（RLC）的脱磷酸活性显著降低。这一机制可能在肝细胞中同样符合。与此同时，还应当考虑到MYPT1/PP1复合物可能还有其它底物作用，发挥效应。如p-Rb, p-Merlin等都要过相关报道。
与此同时，目前没有可以提高MYPT1蛋白水平的小分子化合物的报道。实验希望通过对肝原代细胞的给药筛选，得到可以提高肝原代细胞的MYPT1蛋白水平的化合物，并小鼠在体实验进行验证。
- 可行性分析
1.立题合理、 立项基础坚实。 1） 我们已经成功的得到了MYPT1肝脏特异性敲除的小鼠。 2） 我们的前期实验结果出入表明了MYPT1的缺失会造成小鼠死亡。2） 拥有一系列结构确证高纯度的化合物库用于筛选。立题合理，创新性强，具有理论研究和实践应用等意义。
2.研究内容和方法明确：论文作者所在的孙宏斌教授团队多年来从事非酒精性脂肪肝、肝再生等方面的机理和药物治疗研究。拥有完整的知识体系和实验技术平台。论文作者2014年入选中国药科大学药学创新人才拔尖计划，基本掌握了一些分子生物学，药理学等的实验方法和文献检索，实验设计能力。
- 研究方法和内容
利用基因型为loxP/loxP,AlbCre-和loxP/ , AlbCre 小鼠交配检栓，收集E10.5,E12.5,E14.5,E16.5,,E18.5的胚胎。对MYPT1 konckout和WT小鼠肝脏经行比较。首先经行实体镜观察拍摄，其后对肝脏组织经行HE染色，TUNEL染色，CM-Dil染色，观察肝脏细胞形态及初步判断基因敲除后肝脏的表型和表现出现的时间。提取合适大小的胚胎肝脏蛋白质和RNA，利用western blot和qPCR对该表型所对应的机制经行初步探讨。
