运用HTRF技术构建激酶抑制剂筛选平台
- 课题背景
激酶(kinase)是一类从高能供体分子（如ATP）转移磷酸基团到特定靶分子（底物），进而使靶分子活化的酶。这一过程被称为磷酸化。蛋白激酶作用于特定的蛋白质，并改变其活性，在细胞的信号传导及其复杂的生命活动中起到了广泛的作用。因此，蛋白激酶成为了继G蛋白偶联受体GPCR之后，第二重要的药物靶点。其中两种激酶靶向药物：美国基因工程技术公司（Genentech）于1998年开发的赫赛汀（Herceptin）和诺华公司（Novartis）于2001年开发的格列卫（Gleevec）在肿瘤治疗领域的成功，使蛋白激酶抑制剂（Protein Kinase Inhibitors，PKI）的筛选在各种治疗领域都成为了热门。为了快捷而高效的从大量待检测化合物中找到对激酶具有抑制作用的化合物，高通量筛选（High Throughput Screening) 是首选的方法。和ELISA等传统方法相比，HTRF技术具有酶用量小、方便快捷、噪音低和信号持续时间长等优点，是应用于高通量筛选的利器。
- 课题目的
建立一种基于均相时间分辨荧光（HTRF，Homogeneous Time-resolved Fluorescence）分析方法，用于丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂的体外高通量筛选的平台,。
实验包括三个部分： 第一部分，对几种激酶：包括Aurora C (AurC), ARK 5 (NuaK1), PIK3CA/PIK3R1 (wild type), SSTK/TSSK6 (wild type), CaMKII alpha (CaMKIIalpha;)以及CaMKIV （CaMK4）等的反应条件进行优化，检测出最合适的反应时间、激酶浓度和ATP浓度这三个条件，同时检测抑制化合物Staurosporine对以上激酶的IC50值。第二部分，进行周期蛋白依赖性激酶(CDK，cyclin-dependent kinases)反应条件和体系的优化，同时完成底物蛋白ATF2 的生物素标记。最后，第三部分，本实验拟对表皮生长因子受体突变体EGFR mutant T790M进行优化和检测。
- 实验原理与方法
HTRF技术将传统的荧光共振能量转移技术FRET与时间分辨荧光技术TRF结合在一起，这种结合方式将FRET的均相实验方式和TRF的低背景特点结合在一起。传统的FRET技术利用距离很近（分子间作用力范围）的两个荧光基团，也就是供体（donor）和受体（receptor）。供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠。当供体受到外来能量激发时，会将能量共振转移至受体，使受体发出可以被检测到的荧光信号。HTRF技术使用铕穴状化合物（Eu3 Cryptate）作为供体，异藻蓝蛋白XL-665作为受体，将他们分别与丝氨酸/苏氨酸抗体（STK antibody）以及链霉亲和素（streptavidin）结合在一起，抗体与底物磷酸化位点结合，亲和素与底物上标记的生物素结合，供体和受体便符合了发生FRET的条件，荧光信号产生；同时，铕穴状化合物在经过了一定的时间延迟后，其信号改变很小，而普通荧光信号（如化合物自身产生的荧光信号）经过一定时间延迟后会消失，这样就可以有效的降低其他荧光信号的干扰，排除假阳性的影响。HTRF采用独特的比值法来进行数据分析，可排除体系内杂质的影响。
激酶优化时，首先给予饱和的底物与ATP，选择合适的激酶浓度和反应时间（在HTRF比值-浓度的曲线上，选择线性良好且信号值与背景信号值比值足够大的点）；之后在固定浓度和反省时间的条件下通过梯度的ATP浓度来得到M-M曲线，得到ATP km值。确定酶浓度、ATP浓度与反省时间三个参数后，用非选择性抑制剂星形孢菌素staurosporine作阳性标准，检测IC50值。
- 研究条件与可能遇到的问题
实验的主要工具是384孔板，各类移液器和酶标仪。实验地点是上海浠思生物科技有限公司实验室。可能遇到的问题包括平行孔数据差距大以及反复冻融试剂活性降低等，均可通过实践积累经验，熟练操作来解决。
- 预期结果
本实验预计得到多种激酶（包括CDK和EGFR mutant等）的优化后反应条件，进而可以建立或完善预期的丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂筛选平台。同时，学生将熟悉激酶优化、生物素标记等实验技能。
