一.研究的目的及意义
在本研究中，我们拟定使用效应因子和 RNAi 抑制子，提高杨树瞬时表达效率，为杨树功能基因组研究创造技术平台。
杨树具有早期速生、适应性强、分布广、种类和品种多、容易杂交、容易改良遗传、容易无性繁殖等特点，因而广泛用于集约栽培。大量早育出来的优良杨树品种，对栽培条件的改善反映很灵敏，可大幅提高生产力，对解决木材短缺起着很大作用。瞬时表达技术可以快速的分析基因的功能、蛋白相互作用和蛋白的细胞定位。植物细胞瞬时表达系统的建立为方便、快捷的研究启动子活性、基因功能和蛋白质定位等开辟了新途径。杨树是木本植物中的模式物种，已有报道杨树原生质体和农杆菌介导的瞬时表达技术，然而其效率偏低，因此在相关领域的应用较为有限。若能进一步研究和完善杨树瞬时表达系统，我们就能进一步在基因组水平上对杨树进行改善，优化其生长，提高生产质量。
二.国内外同类研究概况
瞬时表达技术是在相对短的时间内将目标基因转入靶细胞，在细胞内建立暂时高效的表达系统，获得该目的基因短暂的高水平表达的技术。与稳定表达相比，瞬时表达所需时间短，不需要将外源基因整合到宿主植物染色体中，比较适用于基因一蛋白的一些细胞生物学研 究。瞬时表达近年来在国内已被应用于多种植物的研究和应用开发，从农作物的小麦 (Triticum monococcum)、玉 米 (Zea mays)、水 稻 (Oryza sativa) J，到园艺观赏植物的矮牵牛 (Peru． nia hybrida)、长春花 (Catharanthus roseus)、香蒲 (Typha orientalis)等以及藻类植物绿藻 (Chlo． rophyta)等都已建立了相应的瞬时表达体系，为其基因功能研究和利用提供了便利 [1]。
瞬时表达系统起源于20世纪六七十年代，称为第一代瞬时表达系统。此时的瞬时表达技术主要应用于 离体细胞、原核细胞中蛋白质的瞬时表达。Hoerz等利用蛋白质的瞬时表达分析了网织红细胞多核糖体中 初始蛋白质的合成；Kryzek 等研究了大肠杆菌 argECBH基因簇在瞬时表达中的调控机制；随着生物 学研究的不断深入，有关瞬时表达的应用也加快了步 伐，如Klein等用基因枪成功地将外源DNA转入完整 的洋葱表皮细胞，在2~4天内表达了外源基因；第二代 瞬时表达系统的研究以原生质细胞为受体，如Fromm 等采用电穿孔技术，将pNosCAT和pCaMCATV质粒 转入玉米原生质体，得到瞬间表达。但第二代瞬时表达系统转化频率低，一般为10-6 ~10-2[10] ，且操作前需要 准备大量的原生质体。第三代瞬时表达系统主要在植物活体中进行相关 的研究，不同物种的瞬时表达体系也逐渐被建立。如柳枝稽瞬时表达系统、优化的烟草瞬时表达系统、草莓瞬时表达系统、莴苣瞬时表达系统、还有油菜籽、洋葱、黄瓜等植物的瞬时表达系统也被研发并应用。
利用瞬时表达体系有助于研究物种的相关基因及蛋白功能，Li利用拟南芥瞬时表达系统研究了d35s 启动子活性、拟南芥中3个基因(At3g51660、 At1g01170、At2g47840)的亚细胞定位及蛋白互作等相关问题；同时该系统也可表达外源基因生产重组蛋白， 为疫苗、抗体、生物制药的研发开辟捷径，如Raffaele在烟草中瞬时表达了HIV-1的辅助蛋白Nef，为HIV疫 苗的研发奠定了基础；Jussi 在烟草瞬时表达体系中 高效表达了来源于里氏木霉的疏水蛋白质基因。尤其在最近十几年内，随着瞬时表达与免疫组化、激光共聚 焦扫描显微镜技术的结合，利用该系统进行相关基因、 蛋白质方面的研究也越来越多，并开始向环境检测、病 毒防治、微生物利用、细胞骨架等方面扩展，标志着瞬 时表达体系在不断完善的同时也将进入更先进的一代[2]。
而效应因子和 RNAi 抑制子用来提高瞬时表达。RNAi即 RNA干涉(或RNA干扰)是指双链RNA导入细胞后并被切割成21-23个核苷酸长度的短核苷酸双链,在其它作用因子的参与下能够特异地与其同源的mRNA结合并导致其降解,从而使得内源基因不能表达,导致内源基因的沉默[3],作为基因敲除的替代方法，已被广泛用于动物、植物和真菌基因的功能分析。
利用RNAi研究植物基因功能，可选择靶基因的一段单一序列使基因家族中的单个成员沉默；也可以选择某一基因家族的多个成员具有的一段同源性很高的 保守序列，设计针对这一序列的dsRNA表达载体使多个基因同时沉默，RNAi成为功能基因组学研究的重要手段[4]。而作为转录后基因沉默的手段，RNAi拥有与传统的基因研究方法所不具备的优势。如针对植物生长发育必需基因的研究，通过传统的基因敲除手段便较难实现。如Nunes等采用RNAi技术沉默GmMlPSl基因，在RNAi再生植株中没有检测到GmMIPSl的表达，同时种子发育受阻现象，表明GmMIPSl基因的表达和种子发育有密切关系RNAi技术亦可用于家族基因的研究，Miki等uml;刚设计水稻OsRac基因家族中高保守性序列构建RNAi载体，结果不同效率地抑制了所有成员基因的表达，并证明该基因家族在生长发育过程中有重要的作用。
