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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 一、研究背景 肿瘤是一类严重威胁人类健康的疾病1，其主要表现为机体内异常细胞的增值失控，并且可向正常组织或器官转移。化疗是肿瘤疾病治疗的重要手段之一，然而在治疗过程中，化疗药物产生的严重毒副作用是其临床使用中的一大弊端2。同时，肿瘤细胞对化疗药物耐药性的产生也是导致化疗失败的主要原因之一3。因此，寻找选择性好，且不易诱导细胞耐药性的新型抗肿瘤药物是当前研究的热点之一。 宿主防御肽（HDPs）是生物体先天免疫系统中的主要成分4，具有广谱的抗菌活性5,6。除了抗菌活性外，HDPs还对肿瘤细胞具有杀伤作用，并且大部分HDPs对正常细胞作用较小。HDPs结构中含有2-9个正电荷氨基酸以及约50%的疏水性氨基酸，其中。正电荷氨基酸和疏水性氨基酸分别位于两侧，构成多肽分子的输水面和亲水面，赋予HDPs两亲性，这导致HDPs可作用并破坏脂质膜。HDPs的抗肿瘤活性主要依赖于其对细胞膜的破坏作用，肿瘤细胞难以对HDPs产生耐药性。前期研究中发现宿主防御肽X-5有较好的抗肿瘤活性,用K562和MCF-7细胞进行抗肿瘤活性筛选，IC50值分别为4.3uM，5.4uM。值得深入研究其作用机制。
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Figure 1 HDPs对细菌细胞膜的选择性
二、拟研究或解决的问题
研究宿主防御肽X-5的抗肿瘤活性及其作用机制
三、文献综述
宿主防御肽（HDP）在多细胞生物的先天免疫系统中具有阳离子和两亲性，具有广谱的抗菌活性.HDP具有大量的碱性氨基酸，例如精氨酸和赖氨酸，而大约一半是疏水性氨基酸。后来发现一些阳离子HDP具有抗癌活性7。与细菌类似，癌细胞膜含有高比例的净负电荷。负电荷在癌细胞膜上的过度分布是由于各种阴离子分子如磷脂酰丝氨酸和O-糖基化粘蛋白的过表达所致。哺乳动物细胞的膜主要由两性离子磷脂组成，包括磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂，其具有净中性电荷。因此，由于静电相互作用，阳离子HDPs可以选择性地与癌细胞结合。由于某些蛋白质如ATP结合盒（ABC）转运蛋白等的分泌，传统的化疗药物在治疗过程中诱导了药物耐药性，导致化学治疗剂的胞吐作用8。与传统的化学疗法相比，HDPs可以通过避免胞吐直接破坏癌细胞膜7,9。因此，针对癌细胞的HDP的作用使得HDP不易受到抗药性的影响10。
四、实验设计
1）X-5的体外细胞毒性研究（选取细胞系：MCF-7、K562、K562/A以及HUVEC）。
2）X-5的溶血性研究。
3）X-5的膜破坏作用研究: 吖啶橙AO/溴化乙锭EB、LDH释放实验。
五、实验方案
1）体外细胞毒性实验
MTT法11，MTT是一种黄颜色的染料，全称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，MTT法是一种检测细胞活力和增殖的比较常用的方法。在活细胞中，线粒体能代谢并且还原外源性的MTT，并在细胞色素C的作用下，生成不溶于水的蓝色结晶甲臜（Formazan）。但在死细胞中，加入MTT则不会发生上述反应。同时利用二甲基亚砜（DMSO）可溶解甲臜的特点，在酶标仪490nm和570nm波长测定其吸光度。因为在一定范围内，甲臜的含量多少与活细胞数量的多少成正比关系。所以，通过这一关系，我们可以用测得的吸光度值（OD值）来大致判断活细胞数量。
2）溶血测定
根据之前文献报道的测定兔红细胞溶血活性的办法12,13，将各种浓度的肽溶液（20-160mu;M，100mu;l）与100mu;l8％（v / v）红细胞悬浮液在37℃下温育1小时。 用酶标仪通过在540nm测量上清液（Bio-Rad，iMark 680）的吸光度来评估血红蛋白的释放。PBS中的1％Triton X-100和4％（v / v）红细胞悬浮液设定为100％，0溶血。 计算[（Abs540nm肽处理 - 未处理的Abs540nm）/（Abs540nm1％TritonX-100-Abs540nm未处理）]100的溶血百分数。测定试验三次。
3）乳酸脱氢酶（LDH）释放实验
LDH一直被认为是受损细胞膜的可靠生物标志物14,15。将MCF-7细胞铺在96孔板（每孔6103个细胞）中并培养24小时。 接下来，将它们与不同浓度的肽在无血清培养基中温育1小时。 通过离心（3000g，10分钟）收集无细胞培养上清液并转移至新的96孔板。 然后，使用商业LDH活性测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测上清液中LDH水平。分别在PBS和0.1％Triton X-100中定义零和100％LDH渗漏。
4）吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）双染实验10
取对数生长期的细胞，并制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度为1-2105个/ml，并在24培养孔板中每孔加入1 ml细胞悬液。5% CO2，37℃条件下继续孵育24 h后，加入指定浓度的药物。作用30 min后，弃去培养基并用PBS溶液清洗细胞2-3次，接着加入1 ml AO/EB染色液。37℃下避光染色10 min，弃去染色液并用冷PBS清洗细胞3次后，在加入500 mu;l PBS溶液覆盖细胞。并将培养板用锡箔纸包裹，置于冰盒上，尽快利用荧光显微镜观察细胞染色情况。
5)结果分析
六、研究计划
2018.022018.03 查阅文献，学习基本细胞实验技能
2018.032018.04 完成活性实验，记录数据
2018.042018.05 处理数据，完成毕业论文
七、参考文献
1 Bode, A. M., Dong, Z. Wang, H. Cancer prevention and control: alarming challenges in China. National science review 3, 117-127, doi:10.1093/nsr/nwv054 (2016).
2 Gu, Y.-J., Cheng, J., Man, C. W.-Y., Wong, W.-T. Cheng, S. H. Gold-doxorubicin nanoconjugates for overcoming multidrug resistance. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 8, 204-211, doi:https://doi.org/10.1016/j.nano.2011.06.005 (2012).
3 Alakhova, D. Y. Kabanov, A. V. Pluronics and MDR Reversal: An Update. Molecular Pharmaceutics 11, 2566-2578, doi:10.1021/mp500298q (2014).
4 Choi, K. Y., Chow, L. N. Y. Mookherjee, N. Cationic Host Defence Peptides: Multifaceted Role in Immune Modulation and Inflammation. Journal of Innate Immunity 4, 361-370 (2012).
5 Hancock, R. E., Haney, E. F. Gill, E. E. The immunology of host defence peptides: beyond antimicrobial activity. Nature reviews. Immunology 16, 321-334, doi:10.1038/nri.2016.29 (2016).
6 Fjell, C. D., Hiss, J. A., Hancock, R. E. Schneider, G. Designing antimicrobial peptides: form follows function. Nature reviews. Drug discovery 11, 37-51, doi:10.1038/nrd3591 (2011).
7 Gaspar, D., Veiga, A. S. Castanho, M. A. R. B. From antimicrobial to anticancer peptides. A review. Frontiers in Microbiology 4, doi:10.3389/fmicb.2013.00294 (2013).
8 Prasad, R. Goffeau, A. Yeast ATP-Binding Cassette Transporters Conferring Multidrug Resistance. Annual Review of Microbiology 66, 39-63, doi:10.1146/annurev-micro-092611-150111 (2012).
9 Tonk, M., Vilcinskas, A. Rahnamaeian, M. Insect antimicrobial peptides: potential tools for the prevention of skin cancer. Applied Microbiology and Biotechnology 100, 7397-7405, doi:10.1007/s00253-016-7718-y (2016).
10 Dai, Y. et al. Pro-apoptotic cationic host defense peptides rich in lysine or arginine to reverse drug resistance by disrupting tumor cell membrane. Amino acids, doi:10.1007/s00726-017-2453-y (2017).
11 魏文青 et al. 应用MTT法进行体外抗肿瘤药敏试验影响因素研究. 华北国防医药, 25-27 (2008).
12 Chen, W. et al. Structureactivity relationships of a snake cathelicidin-related peptide, BF-15. Peptides 32, 2497-2503, doi:https://doi.org/10.1016/j.peptides.2011.10.005 (2011).
13 Deng, X., Qiu, Q., Wang, X., Huang, W. Qian, H. Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Novel Cholesteryl Peptides with Anticancer and Multidrug Resistance‐Reversing Activities. Chemical Biology Drug Design 87, 374-381, doi:10.1111/cbdd.12667 (2016).
14 Cho, M.-H. et al. A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker. Toxicology in Vitro 22, 1099-1106, doi:https://doi.org/10.1016/j.tiv.2008.02.013 (2008).
15 Jurisic, V., Radenkovic, S. Konjevic, G. in Advances in Cancer Biomarkers: From biochemistry to clinic for a critical revision (ed Roberto Scatena) 115-124 (Springer Netherlands, 2015).
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