信号肽pelb介导藻蓝蛋白分泌表达的研究
- 摘要
信号肽在引导外源蛋白的跨膜转运过程中具有重要作用，本实验通过获得带有信号肽pelb的序列和不带信号肽序列的质粒，构建表达载体在大肠杆菌中进行诱导表达，验证pelb对藻蓝蛋白运输到胞外的作用及胞外蛋白表达量与诱导剂种类和诱导剂剂量间的相关关系，可为提高藻蓝蛋白产量提供理论及经验支持。
- 关键词：信号肽 藻蓝蛋白 表达条件
- 正文
向BL21大肠杆菌菌株中分别导入 petd-pelb-cpcb、pet-sa及 pted-cpcb、pet-sa 质粒，得到两种不同种可分泌藻蓝蛋白的菌株，其差异在于是否含有胡萝卜软腐欧文氏果胶酶裂解酶即pelb的遗传信息，而pelb是一种信号肽，具有诱导胞内蛋白分泌到胞外的功能，通过诱导时改变诱导剂种类和剂量可以得到不同的胞外藻蓝蛋白分泌量。藻蓝蛋白是一种具有很高价值的蛋白质，可以为藻蓝蛋白的批量生产提供理论及经验支持。
1 BL21大肠杆菌菌株
coli BL21来源于B株，是最早开发的用于原核表达的菌株，为lon蛋白水解酶、ompt外膜蛋白水解酶缺陷型，因此表达的外源蛋白在该体系中具有更高稳定性。大肠杆菌是最广泛使用的生产重组蛋白的宿主菌，其培养方式简单、生长迅速、成本低、遗传背景清楚且重组子稳定，是被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物[1]。
2藻蓝蛋白
藻蓝蛋白（C-PC）是一种从螺旋藻、鞘丝藻、集胞藻等藻类中提取的色素蛋白，主要由a亚基和b亚基组成,属于藻胆蛋白（PBP），其必需氨基酸的含量较高，是一种重要的食品添加剂；具有抗肿瘤和抗炎活性；藻蓝蛋白也可以清除受损的神经细胞自由基，避免DNA氧化损伤，从而防止自由基引起的神经细胞凋亡[2]；且由于其可发出荧光、量子产量高，易于同生物素和抗体等物质结合，可作为荧光标记物，因此藻蓝蛋白在食品、药学、医学、环境科学和细胞生物学等领域具有广泛的应用前景[3-4]。藻蓝蛋白可直接从蓝藻中提取，但是由于养殖条件严格、分离技术复杂且效率低，因此天然养殖所获得的表达蛋白产量较低[5-6] 大大限制了藻蓝蛋白的应用和发展。重组藻蓝蛋白理化特征与天然的藻蓝蛋白非常相似,且具有分泌量高、可人工调控等优势，可以通过人为操作构建高表达量的藻蓝蛋白分泌重组子，从而在适宜培养表达条件下获得高蛋白产量。
3信号肽
信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，存在于新生肽链端的一段特殊的氨基酸序列,通常由几个氨基酸残基组成,信号肽的基本构成为:一个基本的端区域,这个区域一般由带正电的氨基酸构成;一个中部的疏水区域,这个区域主要由疏水氨基酸构成;一个有着更强极性的区域,这个区域的由极性氨基酸组成[7]。信号肽假说认为，编码分泌蛋白的mRNA在翻译时首先合成的是N末端带有疏水氨基酸残基的信号肽，它被内质网膜上的受体识别并与之相结合。信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔，随后被位于腔表面的信号肽酶水解，由于它的引导，新生的多肽就能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外。翻译结束后，核糖体亚基解聚、孔道小时，内质网膜又恢复到原先的脂双层结构[8]。信号肽是蛋白质分泌转运过程中引导新生肽转移到内质网腔膜上的信号肽识别蛋白,并引导蛋白质分子分泌到特定位置的一段氨基酸序列,因此信号肽作用于蛋白质新生肽转运的整个过程中。信号肽在外源蛋白质的表达中具有重要作用，选择合适的信号肽才能促进目的蛋白的表达。信号肽pelb是一种强分泌性信号肽，可引导基因表达产物藻蓝蛋白分泌到培养基中，有利于蛋白产物的正确折叠，还可避免包涵体复性带来的困难，而且可以极大简化分离纯化工艺，减少表达蛋白对宿主菌的毒性和代谢负担，可显著提高表达量[9]。
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