血管内皮细胞萃取与HPLC-MS联用法识别生脉散的活性成分研究文献综述

 2023-02-02 10:02

开题报告

一、拟研究或解决的问题:

本课题拟建立血管内皮细胞萃取-HPLC分析法,通过比较生脉散与正常及病理模型下血管内皮细胞作用前后的化学指纹峰变化情况,筛选研究以血管内皮细胞为作用靶细胞的生脉散的效应成分,为进一步阐释生脉散防治心脑缺血疾病主要活性成分群奠定基础。

二、采用的研究手段:

1 人脐静脉内皮细胞的培养

选用稳定的人脐静脉血管内皮细胞株,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养,长满瓶底的80%时,倒去培养基,PBS洗两次。以0.25%的胰蛋白酶消化2 min,倒置显微镜下观察,当细胞皱缩变圆,彼此分开时加含血清的RPMI1640培养基终止消化,轻轻吹打使细胞悬浮,500 rpm/min离心3 min,弃上清,2 mL培养基吹散,按1:6的比例接种于培养瓶中,置于37℃培养箱中培养。选均匀铺满瓶底,排列整齐,胞浆饱满,生长良好状态均一的细胞供实验用。

2 内皮细胞和生脉散提取液中成分的结合

选择处于指数生长期的内皮细胞,加入无血清的RPMI1640溶液,在 37 ℃、 5%CO2条件下孵育2 h,倒掉无血清的RPMI1640溶液,加入用无血清的培养基溶液配制的样品溶液,在37 ℃、5% CO2 条件下培养0.5 h,吸取上清液备用,用生理盐水冲洗5次,取1 mL第5次洗脱液备用。洗过的细胞加80%甲醇解离,解离液减压挥干,用甲醇溶解,15000 r/min离心10 min,取上清液备用。

3 生脉散与内皮细胞结合成分的色谱分析

采用HPLC对血管内皮细胞活性成分解离液进行色谱分析,并采用MS对所结合化合物进行结构鉴定。采用 PDA 检测器全波长扫描,获取不同波长下的数据,综合考虑生脉散组成药味的化学成分的性质,检测波长定254 nm,203nm和296nm。

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