生物工程肝素前体物制备
研究背景和立题依据：
目前肝素是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其是血液透析治疗中唯一有效的特效药物。临床应用及研究显示，肝素除具有抗凝血作用外，还具有其他多种生物活性和临床用途，包括降血脂作用、抗中膜平滑肌细胞（SMC）增生、促进纤维蛋白溶解等作用。此外，低分子肝素是由肝素原料药作为原料进一步加工成的一大类抗血栓的药物，具有更为广泛的临床医学用途，成为治疗急性静脉血栓和急性冠脉综合症（心绞痛、心肌梗塞）等疾病的首选药物。
肝素是分子结构很复杂的化合物，目前医药级别的肝素均是从动物组织中提取得到,虽然利用动物提取肝素方法简单易行,但是随着全球对肝素的需求的不断增加,仅利用动物来源的原料，人工化学合成，提取得到肝素已经不能满足需求,与此同时,疯牛病的发生以及2008 年发生的过硫酸软骨素污染事件,使人们对从动物体获得肝素的安全性提出了质疑。为此,采用安全有效的方法合成肝素是需要首要解决的问题。化学方法合成肝素类似物的最成功的方法,如Arixtra 已应用于治疗血栓。然而,化学合成过程复杂且成本高,市场竞争力差。利用微生物来源的heparosan 合成抗凝血的肝素以及硫酸乙酰肝素成为目前研究的最新热点。
实验室规模研究已经表明heparosan 是构成大肠杆菌K5 和巴斯德菌D 型的荚膜多糖的成分,利用巴斯德菌D 型产生的heparosan 的分子质量为200~300 kDa,而大肠杆菌产生的heparosan 的分子量为3 ~150 kDa,其分子质量更接近于肝素的分子量大小。因此,利用大肠杆菌K5 荚膜多糖heparosan 作为前体合成肝素以及硫酸乙酰肝素得到人们的广泛关注。Heparosan能被酶催化转化为类似于肝素的抗凝血聚多糖。从微生物来源的Heparosan制备生物工程肝素为人们从动物体提取肝素提供了一个新的选择。
Heparosan荚膜多糖由{→4) beta; - D -葡萄糖醛酸 (GlcA) (1→4)N-乙酰-alpha;-D -氨基葡萄糖 (GlcNAc) (1→)]n}重复的二糖单位组成。在真核细胞中，Heparosan是生物合成肝素和硫酸乙酰肝素的前体，具有重要的生物学作用：参与到凝血、病毒和细菌感染、入侵、血管生成、炎症、癌症和发展。K5 Heparosan多糖的结构和生物合成肝素和硫酸乙酰肝素前体物Heparosan相似。因此，K5 Heparosan在人类表现出较低的免疫原性，包括泌尿系统感染。报道K5 Heparosan合成起始需要2-酮基-3-脱氧辛酮酸参与。K5 Heparosan之后的延伸需要在其非还原端通过糖基转移酶 KfiA and KfiC的交替作用添加GlcNAc and GlcA延长多糖链。一旦合成，Heparosan链经过一个由六个蛋白（KpsC,KpsD, KpsE, KpsM, KpsS, and KpsT）组成的通道运送的细胞表面。K5 Heparosan链锚定在细胞表面通过脂质置换到大肠杆菌细胞外膜的磷脂酸多糖还原端。部分Heparosan多糖从菌体上裂解出来，是通过来至于噬菌体具有beta;-消除反应裂解Heparosan链的K5 Heparosan酶的作用。编码K5酶的基因整合到大肠杆菌K5 DNA中，其表达可能是诱导型。K5 酶的活性能够影响释放到培养介质中Heparosan的数量，同时也对细胞表面和释放的Heparosan结构和分子量都有影响(Fig. 1B)。K5 Heparosan已经被估算出分子量Mw20,000，主要由两个亚单位Mw16,000 and 1,500组成。两种亚单位的比例影响整体分子量，也受到K5酶活性影响。控制Heparosan分子量特性是很重要的，肝素的生物学特性十分依赖于多糖链的大小，而其由最终依赖于Heparosan前体物链尺寸。当前研究方向主要集中于检查大肠杆菌K5的发酵，以此提高Heparosan产量和体积产率。
实验内容：
试剂和仪器:
大肠杆菌K5、高温高压灭菌反应器、摇床、低温离心机、超净台、透析袋、旋转蒸发仪、冻干机
