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一、选题依据（包括研究意义、国内外研究现状、本研究的创新点等。参考文献请另附页）： 1 研究意义 酚酸类化合物在工业生产和药学领域有相当重要的作用，由于其强大的抗菌活性和抗氧化活性，它们对健康有多重好处，被广泛应用于医药、食品领域。对香豆酸广泛存在于种子、水果和蔬菜中，是许多酚类化合物的前体，是聚合成高性能聚合物的优良前体。然而由于植物生长周期长、缺乏有效从植物体中提取对香豆酸的方法等因素限制了其在生产中的应用。微生物（如大肠杆菌、酿酒酵母等）的代谢工程、基因工程、酶工程技术近年来发展势头迅猛，被广泛应用于天然药物的合成开发，可以大大减少传统植物提取的时间和经济成本。酪氨酸氨基裂解酶TAL在对香豆酸的合成过程中是限速酶，基因工程技术证明过表达或者提高酪氨酸氨基裂解酶TAL活性都可以有效提高对香豆酸产量，从而提高对香豆酸的产量。本研究主要利用酶工程、代谢工程等多种技术增加限速酶酪氨酸氨基裂解酶TAL的活性从而促进对香豆酸的合成，减少合成过程中原料消耗等成本，为后续芳香类酸的合成提供快捷通道。 2 国内外研究现状 对香豆酸是一种天然的酚类化合物，在植物中广泛存在，具有多种药理活性，包括预防心血管疾病，抗氧化、抗菌消炎、保护心脏、利胆利肝、及抗病毒等功效。此外，对香豆酸也是咖啡因、阿魏酸、柚皮素、香豆素、白藜芦醇等天然产物的合成前体，是一种重要的有机化工原料。目前，对香豆酸具有高能耗、副产物多、产率低、高污染等问题。生物合成生产对香豆酸近年来受到广泛关注。 近几年来有不少研究人员通过工程改造微生物致力于提升L-酪氨酸的产量进而提升香豆酸产量。J.L. Rodrigues等[1]将来自Rhodotorula glutinis（粘红酵母）的TAL整合入咖啡酸的合成途径中，并比较不同拷贝数的质粒筛选出高拷贝最优质粒，并用酪氨酸作为底物直接合成重要中间体——对香豆酸，然后首次用细胞色素P450系列的羟化酶CYP199A2及其氧化还原组件促进对香豆酸到咖啡酸的转化。Yan[2]等人在之前大肠杆菌内源性羟化酶4HPA3H的基础上改造了一种苯丙氨酸的高产菌，使其转化为酪氨酸高产菌，再在引入密码子优化的RgTAL基础上在改造单启动子质粒为双启动子质粒，最后咖啡酸产量达766.68mg/L。Yun Chen团队[3]则是重新设计了酵母的中心代谢，在对香豆酸的合成途径引入磷酸酮糖途径，通过替换途径中的关键基因启动子来优化糖酵解通量和芳香族氨基酸生物合成间的碳流分布，最后对香豆酸产量达12.5g/L。 综合前人研究发现，虽有文献提到将L-酪氨酸催化为对香豆酸产量，但未从本质上改进酶的结构进一步提高酶的催化活性。 3 创新之处 基于前人利用整合、密码子优化、引入新通路、切断负反馈调节通路等多种方式促进对香豆酸的合成。同时有研究报道科研人员利用定向趋异进化的方式改造羟化酶HpaBC，使其有对两条不同合成通路的底物都有催化活性，合理分配在两条路径中的代谢碳流，提高了底物到终产物的转化率（转化率为82%）。基于以上研究，本次课题利用蛋白工程、酶定向进化技术改造关键酶——TAL，具体在于利用分子模拟软件模拟出能与酪氨酸、左旋多巴亲和力最好的TAL最适构型，利用定向趋异进化策略获得对氨基裂解酶TAL进行了改造，获得了分别具有酪氨酸氨基裂解酶、左旋多巴氨基裂解酶及左旋多巴/酪氨酸氨基裂解酶混杂催化活性的三个优良突变体。用同一套途径酶设计了两条不同的以酪氨酸为底物生产香豆酸的生物合成途径，优化从酪氨酸到香豆酸的碳流分布，减少代谢负担。 参考文献
二、研究目标、研究内容、拟解决的关键问题： 1 研究目标： 利用酶定向进化策略优化限速酶——酪氨酸氨基裂解酶的结构提升催化活性从而促进对香豆酸的合成
第一章：酪氨酸氨基裂解酶序列和结构分析 第二章：对来自Rhodobacter capsulatus（荚膜红细菌）的TAL进行突变 第三章：TAL的活性表征 3 拟解决的关键问题： 3.1 基于不同生物来源的酪氨酸裂解酶的氨基酸序列分析，进行合理的分子模拟，寻找酶的柔性结构，并进行结构改造； 3.2 用何种方式制备TAL的突变体； 3.3 如何在大量突变体文库中筛选到所需的突变体； 3.4 用何种质粒表达？用何种启动子？用哪一种大肠杆菌宿主； |
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三、研究方案（拟采取的研究方法、技术路线、实验步骤、可行性分析、可能出现的技术问题及解决办法）： 1 拟采取的研究方法 1.1 根据氨基酸分析软件对比不同物种的酪氨酸氨基裂解酶TAL的氨基酸序列，分析哪些是高保守序列，哪些是柔性结构；利用分子对接软件分子底物在TAL结合口袋内的分子相互作用，分析底物与口袋内的氨基酸残基，哪些残基是保守的，哪些是灵活可变的，据此设计相应的突变策略对原始的TAL进行突变。 2 技术路线
3实验步骤 3.1 酪氨酸裂解酶TAL进行密码子优化 用其他生物来源的TAL对酪氨酸进行催化产对香豆酸产量依然较低，即使对异源的TAL进行密码子优化，改善对香豆酸的产量。计算机模拟得到的结果：将R9TAL的397、948、400、401位突变为甘氨酸，可提高酶的活性。 3.2 引物的设计 依据引物设计原则，进行引物设计：M1-1F1、M1-1F2、M1-1R1、M1-1R2 3.3 PCR扩增目的基因 将PCR反应管至于PCR扩增仪中， 第一步：94℃ 变性反应5min 第二步：94℃反应30s；57℃ 退火40s；72℃ 延伸40s，重复循环30次 第三步：72℃延伸5min，-4℃保存待用。 3.4 琼脂糖凝胶电泳及凝胶纯化 3.5 限制性内切酶的酶切反应 3.6 利用T4连接酶与线性化的PET24a( )进行体外的连接 3.7 将重组质粒转化进入Top10大肠杆菌中并进行铺板 3.8 阳性克隆筛选，进行菌液PCR鉴定 3.9 将经过阳性克隆筛选的菌落放入液体培养基中培养12h，测序，抽提质粒。 3.10 将提取的质粒导入至BL21菌株中，进行铺板、阳性克隆筛选、培养12h。 3.11 得到菌液，接种10%体积菌种液至发酵培养基中，培养发酵10h，后加入IPTG诱导4h，取上清液。 3.12比较对香豆酸合成途径的催化效率 在培养获得含有不同通路的重组菌株以及野生型菌株14h,分别用HPLC检测底物酪氨酸、对香豆酸的浓度，绘制对应的时间-浓度变化曲线，通过比较两条通路中各自底物和中间体的浓度变化判断TAL突变体的催化能力。 对香豆酸、咖啡酸色谱条件：检测波长310nm（对香豆酸），323nm（咖啡酸），流速：1ml/min，柱温：30℃，流动相A：0.1%TFA水溶液，流动相B：乙腈；色谱梯度程序：0到15min（10%~50%B），15到16min（50%~10%B），16到20min（10%B）。 酪氨酸、左旋多巴色谱检测： ①衍生试剂配制：量取FDNB 12.6mu;l，并用1.2ml乙腈溶解，得90mM的FDNB溶液，再用乙腈稀释FDNB溶液至其终浓度为0.9mM； ②衍生反应：吸取样品或酪氨酸标准品溶液150mu;l至离心管中，加入200mu;l 0.5M NaHCO3，吸取150mu;l 0.9mM的FDNB溶液，涡旋混匀，于50℃下反应10min，加入1ml的0.1M KH2PO4（或0.1M NH4Ac）缓冲液(PH=7)终止反应，用0.45mu;m有机滤膜过滤，备用； ③流动相A：0.5%NH4Ac: ACN = 85:15 (PH=8.0) 流动相B：50%乙腈水溶液 ④色谱条件：ODS C18柱，柱温：30℃，流速：1ml/min，检测波长：360nm，进样量：10mu;l ⑤梯度程序：
光响应的细胞分选出来。④阳性筛选：将③ 中选出的细胞用含1mM的LB培养基培养12h后用FACS筛选出具有最强荧光响应的细胞。⑤经过7轮阴性、阳性交替筛选，选出对咖啡酸有最强响应的PadR突变体T0和其他5个有较强响应的突变体，并将其摇瓶培养大量扩增，用试剂盒抽提出质粒，测序。 4 可能出现的技术问题 4.1若有大量的TAL突变菌株，挑取克隆工作量会很大；另外用HPLC检测TAL突变体菌株的对香豆酸中间体和对香豆酸含量筛选高活性TAL费时费力。 4.2若分子模拟后的TAL实际活性并不高，可能需要改变配体结合口袋的柔性氨基酸序列进一步筛选。 4.3 所得突变体蛋白晶体结构分析条件有限。 4.4 在胞内表达的生物感受器能否准确反映胞外产物浓度？ |
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四、基础及条件（包括已经做过的相关研究工作，本单位或外单位可供使用的仪器设备和实验条件等）： 1已经做过的相关研究工作： 构建出酪氨酸的高产菌、已有报道对对香豆酸有很强活性的羟化酶HpaBC。 2实验条件 （1）拥有实验所需的主要仪器与设备：如电泳仪、紫外分光光度计、A300型PCR 仪（朗基，中国）、SPD-20A高效液相色谱仪（岛津，日本）、FORMA3111 型CO2 培养箱、AXVORE4600凝胶成相系统（美国天能）、TG16MW型高速离心机（赫西，中国）等开展分子生物学操作和测定用设备和条件。但无多功能酶标仪、蛋白纯化试剂盒、96孔板离心机、FACS流式细胞分选仪、拉曼光显微镜 （2）实验材料：
五、毕业设计（论文）进度计划、起止时间： 2021.2.25-2021.4.25 完成实验及数据收集 2021.4.25-2021.5.25 完成毕业设计(论文)写作 起止时间：2021.2.25-2021.5.25 |
