开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、背景及综述
1磷酸化蛋白质组
1.1磷酸化蛋白质组
蛋白质的磷酸化修饰是由蛋白质激酶催化，将三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）上的磷酸基转移到蛋白质氨基酸残基上的过程。蛋白质磷酸化是蛋白激酶与蛋白磷酸酶之间的复杂调控过程，具有严格的时间性和空间性，发生在特定蛋白质的特定位点上。一个蛋白质通常含有多个磷酸化位点，不同位点往往由不同激酶调控，不同位点发生磷酸化可能导致蛋白行使不同的功能。
蛋白质磷酸化在真核生物中主要发生在丝氨酸（Serine，S）、苏氨酸（Threonine，T）和酪氨酸（Tyrosine，Y）残基侧链的羟基上，而在细菌中磷酸化则主要发生在天冬氨酸（Aspartic acid，D）、谷氨酸（Glutamic acid，E）和组氨酸（Histidine，H）等残基上。在哺乳动物细胞整个生命过程，1/3以上的蛋白质会发生磷酸化修饰。这一可逆过程几乎调节着包括细胞增殖、分化、凋亡、信号转导、新陈代谢、肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。异常的磷酸化调节与人类的疾病密切相关。磷酸化蛋白质组从整体上认识蛋白质翻译后磷酸化修饰，为研究细胞、组织中磷酸化修饰状态及变化，提供了一个全面的研究视角，是对以传统分子生物学手段为基础，以单个激酶作为研究对象的研究方法的重要补充。
目前常用生物质谱技术识别和鉴定蛋白质磷酸化位点，但一个细胞中的蛋白质不仅多达上万种，而且它们的动态范围又很宽，例如血浆中蛋白质浓度的动态范围在109～1012，而在生物体内的蛋白质总量比例中，磷酸化蛋白质的表达量仅占不到10%，所以酶切后大量的非磷酸化肽段会掩盖磷酸化肽段；其次，磷酸化肽段具有负电性，因此在质谱分析正离子模式下响应很弱；再次，同一个蛋白质可能存在不同类型和位点的磷酸化修饰，而这些修饰通常是不稳定的，并且磷酯键较肽键容易断裂，这些使得磷酸化蛋白质的分析比非磷酸化蛋白鉴定困难得多。因此，无法有效的在不经预分离的情况下，对低丰度磷酸化蛋白质/肽进行鉴定分析，所以，发展高效的分离富集技术对磷酸化蛋白/肽的鉴定分析具有十分重要作用。
目前针对蛋白质组的分析方法主要采取两种模式，即“top-down”和“bottom-up”分离模式。“top-down”是指在蛋白水平上对混合物进行分离，对完整的蛋白质进行识别，随后酶解和进行质谱鉴定，“bottom-up”则是先提取总蛋白酶，随后酶切转化为肽段混合物，再进行分离分析、质谱鉴定，通过肽序列推测蛋白质。因此，根据这两种分析模式，磷酸化蛋白质组富集策略可以分为基于蛋白质水平和肽段水平的富集方法。其中“bottom-up”在蛋白质组分析中更普遍，尽管该方法无法准确的识别全部的复杂蛋白质异构体，但可以克服“top-down”模式在蛋白质碎裂及离子化分析技术中的局限和不足。
1.2磷酸化蛋白质组的富集策略
目前，基于磷酸化蛋白中磷酸基团的化学、物理性质而建立起来的富集方法中，最常用的是免疫沉淀富集法，即利用抗体的特异性，识别磷酸化蛋白并与之结合。获得的磷酸化蛋白，可以通过质谱技术进行定量分析。Zheng等[4]采用细胞培养中氨基酸稳定同位素标记技术（Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Cultures, SILAC），以 EphrinB1-Fc刺激NG-108标记的细胞，用抗酪氨酸抗体PY99，通过免疫沉淀富集了磷酸化酪氨酸蛋白质，酶切后进行LC- MS/MS分析，共鉴定到127个磷酸化酪氨酸蛋白。
