干细胞（stem cell）因其具有高度自我更新和多向分化潜能成为再生医学领域最有应用前景的种子细胞资源，根据其胚胎发育和组织来源可以分为胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和成体干细胞（adult stem cell）、诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）类型，其中成体干细胞中的间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）因其不存在伦理的问题1,2，并具有多向分化潜能及细胞因子分泌功能等，成为理想的“种子细胞”资源。Mscs在体内外可分化为脂肪、软骨、成骨、肝细胞、胰岛细胞、神经细胞、内皮细胞等细胞类型3，亦可与成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞等起到相互支撑支持作用。同时，MSCs可分泌胰岛素生长因子（IGF-1）、成纤维生长因子（bfgf）、血管内皮生长因子（VEGF）等细胞因子，以及白介素1（Il-1）、白介素6（Il-6）、白介素8（Il-8）、骨形成蛋白（bmps）等免疫调节趋化因子等4，间充质干细胞细胞治疗原理图，请见图1。 MSCs因其具有多向分化潜能及分泌免疫调节因子、细胞生长因子的能力，被广泛应用于骨损伤、骨关节炎、老年痴呆等多种疾病的临床研究中。MSCs易于分离、扩增、运输和储存，并易于标准产业化制备，极具产业化和临床应用前景。目前，世界范围内已经批准的干细胞治疗产品主要为间充质干细胞，如治疗移植物抗宿主病、急性心肌梗塞等，显示了较好的临床治疗应用效果和前景。而国内MSCs产业链处于存储阶段，尚无MSCs产品获批，主要在于干细胞的临床前基础及应用研究仍需系统深入，许多问题如：（1）MSCs来源有限，除脐带、胎盘外，其他组织来源均受自体或供体的衰老、疾病状态以及遗传背景影响，体外扩增培养的代数和数量也有限，并且体外培养带来的细胞的不稳定性会增加临床治疗的风险；（2）干细胞异质性及功能亚群不确定，导致的治疗效果不一，效率不稳定等；（3）MSCs亚群的体内外功能活性亟待明确。综上，急需建立间充质干细胞功能亚群鉴定方法，筛选功能亚群marker，为进一步提高和改善MSCs临床治疗效果提供策略。
自1968年，Friedenstein等人5首次从骨髓中发现并由Caplan等人6于1995年首次开展第一例骨髓MSCs临床试验以来，目前世界范围内已经上市10款MSCs产品，用于治疗移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD），心肌炎症（myocardial infarction，AMI）及膝盖软骨损伤修复（knee articular cartilage defects）等疾病；以上干细胞产品基本来源于骨髓MSCs，然而骨髓来源MSCs由于介入性取样、分离效率低等技术难题，急需开拓更广泛的MSCs组织来源。近年来发现，在脂肪、脐带、胎盘等组织同样存在着大量的MSCs7–9，其符合国际细胞治疗协会对MSCs的定义要求：即表达CD73、CD90、CD105而不表达CD34、CD45、HLA-DR等。目前在美国临床试验官网（Clinical Trail）已备案的基于MSCs的临床试验共 700余项，包括治疗心脑血管系统、骨及软骨缺损等多种疾病治疗研究，其中约20%的项目处于III-IV期临床阶段，更多的项目处于I-II期阶段，一方面体现了研究者对MSCs应用能力和前景寄予厚望，同时也预示着需要投入大量的人力和物力和新技术推动MSCs临床研究和进一步市场产业化。 MSCs具有天然的潜能分化为成骨、软骨等中胚层组织细胞类型，成为骨关节炎、骨及软骨缺损修复治疗的理想细胞材料，已批准上市的MSCs产品中有2款产品是用于治疗膝盖软骨关节炎症，并且行业巨头Osiris公司正在开发另外2种基于纳米材料和MSCs的复合型骨及软骨修复干细胞产品，目前正在开展临床试验中；此外，美国EpiBone公司开发一种头盖骨修复MSCs产品，目前已在小鼠和猪上完成动物实验，已提交美国FDA待批准开展临床试验并得到商业界的风投人的融资10；另外，在美国Clinical Trail已备案基于MSCs的骨关节及软骨缺损治疗临床试验共31项。 21世纪以来，世界各国先后投入到干细胞应用技术开发热潮中，美国、加拿大、韩国先后批准几种MSCs产品，而国内MSCs产业链处于存储阶段，尚无MSCs产品获批，究其原因在于应用产业化道路上安全有效标准的缺乏，急需建立间充质干细胞功能亚群鉴定方法、及对应功能亚群功能的验证，并应用于后续细胞治疗前临床评估，为进一步提高和改善MSCs临床治疗效果提供策略。
图 1间充质干细胞细胞治疗原理示意图11
研究发现，MSCs存在着明显异质性，表现为不同个体或组织来源的MSCs在表面标志表达、分化潜能、分泌因子种类和数量等方面存在较大差异，同一单细胞克隆来源MSCs亚群在体外扩增不同代次之间细胞表面marker的表达、染色体异常程度差异也较大，且有害突变数量多的亚克隆随着传代过程而累积，增加了致瘤风险并限制了细胞多次扩增传代后的临床应用12,13，MSCs异质性一方面是由于体外分离培养方法差异导致，也是由于MSCs在体内微环境中固有的分化状态呈现多样性，即存在不同的功能亚群，不同MSCs亚群在细胞形态体积大小、长梭形或者扁平状形态变化、增殖周期、基因表达、表观修饰状态、表面蛋白标志等水平存在明显的细胞与细胞间变异，从而导致不同亚群在分化潜能、生物特性及医学应用潜能方面存在显著差异14,15。 自2001年，Zuk及其同事首次发现脂肪MSCs并且相对骨髓MSCs具有较高的增殖活性、旁分泌和自分泌细胞因子、多向分化潜能、取材相对容易16–18等优势逐渐应用于糖尿病、骨及软骨损伤修复，医疗美容、帕金森等领域19–21。此外，脐带组织成分明确，包括2根脐动脉和1根脐静脉和间质胶体，并且从胶体里可以分离出大量MSCs，相比骨髓、脂肪来源MSCs具有较低的免疫原性和成骨分化潜能22,23，并且体外培养10代仍表达高水平的MSCs相关CD73、CD90和CD105等表面标记24。近年来研究发现，MSCs存在明显的异质性，并且发现脐带、脂肪、胎盘来源MSCs在细胞因子释放和分化方向存在偏向性25,26。不同亚群在除了细胞形态、分化能力上差别外，在基因、蛋白表达水平存在差异，包括C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4)、platelet-derived growth factor receptor (PDGFR)、vascular cell adhesion protein (VCAM)-1、CD106等27,29；不同亚群细胞表观调控状态存在差异24，针对MSCs异质性群体的临床应用需要进一步鉴定区分亚克隆的细胞形态特点、分化能力、细胞因子释放及免疫调节能力、特异性的分群基因、蛋白及表观markers鉴定[51]，近几年，研究者利用MSCs表面蛋白标志来进一步区分其功能亚群，发现CD146 、LepR 、CD271 MSCs亚群更容易分化为成骨细胞、软骨细胞30,31，Stro-1 MSCs亚群更容易促进血管生成特点，CD44 、CXCR4 MSC亚群在迁移和归巢能力方面更为突出32，而CD106 、CD271 MSCs亚群发挥较好的免疫调节作用，此外，Nestin 、SSEA-4、CD44等表面蛋白亦有研究可以用于鉴定区分MSCs功能亚群分类。Freeman BT 研究团队利用单细胞RNA-seq分析骨髓来源单个MSCs细胞在成骨、软骨和脂肪等分化、免疫调节相关基因存在明显异质性；Walmsley GG等人利用242个人细胞表面标志成功分析了脂肪间充质干细胞的亚群分析，发现CD164 亚群促进成骨分化；CD36 , CD40 , CD146 , CD164 ,和CD271 亚群更促进成脂分化方向33,34。
单细胞测序技术是近十年来最热门的技术之一，在细胞发育以及各类疾病研究中都展示了十分广泛的应用前景。单细胞转录组测序技术在近几年发展迅速。哺乳动物单个细胞中的RNA大约只有10pg，其中mRNA只有约0.1pg，因此单细胞RNA-Seq在建库前需要进行全转录组扩增。目前常用的单细胞测序技术包含Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq以及DROP-seq。 （1）Smart-seq（Switching mechanism at 5rsquo;end of the RNA transcript） SMART可以从单细胞生成全长cDNA的测序文库。该技术利用MMLV逆转录酶来进行cDNA链的合成，这种酶可以在转录延伸末端继续产生CCC突出序列，通过加入带有GGG的引物序列的方法引入PCR引物序列，最终实现通过常规PCR进行扩增。SMART能够构建全长cDNA文库，覆盖整个转录组，可以应用的研究领域十分广泛。不仅能分析每个转录本的全部外显子，从而检测不同的剪接变体47。
图2. Smart-seq2示意图 （2）CEL-seq（Cell expression by linear amplification and sequencing） CEL-seq技术发表于2012年，由以色列理工学院的Yanai开发。其大致流程为分离单细胞，反转录mRNA片段后加上cell barcode。CEL-seq采用线性扩增，与PCR扩增相比，重复性，灵敏度更高48。 图3. CEL-Seq2实验流程概述如图，其中在原始的CEL-Seq基础上修z改的步骤标上了红色48。 （3）SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing） Broad研究所开发的SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing）技术采用的是PCR扩增。该技术需要结合流式细胞仪（FACS）或者其他细胞分选方法，把单细胞分配到微孔里去。SCRB-seq与Smart-seq比较相似，只不过SCRB-seq会整合特异性的细胞条码，以分辨扩增分子的来源，更准确的定量转录本。此外，SCRB-seq并不生成全长cDNA，而是像CEL-seq一样富集RNA 3rsquo;端49。
图4. (a)细胞，索引条形码（由水凝胶珠递送），和反转录-细胞裂解溶液共同包被在微流体液滴中。红色箭头指出单个的细胞，黑色的箭头标出流向。当收集到预定的细胞数量之后，光能切割，释放出水凝胶中的条码序列，开启mRNA的反转录。比例尺：100微米(b)液滴中的单细胞转录组的索引条码原理图。细胞和水凝珠共同包被后，利用大于350纳米波长的紫外线（不破坏DNA/RNA）切割释放出索引cDNA引物,接下来进行mRNA的捕获和反转录。(c) cDNA引物索引连接在水凝胶珠上的原理图。mRNA表示为棕色，cDNA为灰色的虚线49。 （4）DROP-seq和inDROP 哈佛医学院的研究人员开发了以微滴为基础的两种独立技术Drop-seq和inDrop。他们利用微流体装置将带有条码的微珠和细胞一起装入微小的液滴，建立了快速、廉价、高通量的单细胞RNA-seq方法。这两种技术将细胞隔离在微小的液滴中，装上用于扩增的条码引物，由此检测数以千计的细胞。Drop-seq和inDrop能够帮助生物学家进一步发现和分类人体细胞，绘制大脑等复杂组织的细胞多样性图谱，更好地了解干细胞分化，获得更多疾病的遗传学信息50。
图5. Drop-seq实验流程图50。 （5）DROP-seq用于解析视网膜双极神经元类型 Cepko团队（HHMI研究所）、Sanes团队（哈佛大学）与Regev团队（Broad Institute），利用DROP-seq对25,000个小鼠视网膜双极神经元进行单细胞转录组测序（Drop-seq法）。聚类分析表明25000个细胞可以被分为大概15个类型，包括一种在细胞形态与空间位置分布均有别于传统神经元的新的神经元细胞类型。此外该研究团队还比较了高通量低深度测序方法（DROP-seq）与低通量高深度测序方法（Smart-seq2），发现前者能够更为有效的用于细胞分型51。
图6. 通过Drop-Seq对双极细胞进行聚类(A)视网膜横截面主要细胞类型的概略图。Rod和cone光感受器接受光刺激并且将光信号转化为化学信号，然后将信号传递给双极细胞。不同种类的双极细胞通过突触结构，与不同深度的内网层的视网膜神经节细胞相联系。(B)实验设计概述。分离出Vsx2-GFP老鼠视网膜，然后通过流式筛选出GFP 细胞。利用Drop-seq单细胞建库、测序。根据处理原始测序结果得到数值表达矩阵。利用主成分分析和图聚类将细胞分类，并且鉴定出不同分类的标记，在后续的体内验证实验中结合细胞形态，检测基因的表达量(C-E)tSNE聚类结果的二维展示图。每一个点代表一个单细胞，不同的颜色表示聚到不同的类(C) Louvain- Jaccard算法 和 (D) Infomap算法，按照聚类结果的簇大小排序。图中的箭头处标出Infomap算法分割了Louvain- Jaccard算法聚类的双极细胞簇。(E)一次Drop-seq实验中细胞用Infomap算法进行聚类的结果51。 （6）DROP-seq用于鉴定新的血液细胞 Broad研究所的Aviv Regev与Nir Hacohen实验室通过, 对健康血液捐献者的血细胞富集HLA-DR 谱系的细胞，得到约2400个单细胞，并进行了单细胞RNA-seq。通过聚类分析，共鉴定并鉴定了6个树突状细胞亚型和4个单核细胞亚型，包含一种新的树突状细胞祖细胞52。
图7. single-cell RNA-seq技术展示人类树突状细胞异质性。(A)实验流程：(i)从血液中分离外周血单核细胞(ii)利用鸡尾酒抗体富集细胞，挑选单个树突细胞和单核细胞。(iii)单细胞转录组数据产出分析。(B)单细胞挑选的方法：树突状细胞定义为live, LIN(CD3, CD19, CD56)阴性 CD14阴性HLA-DR阳性的细胞。三种宽松又有交叉的门控策略保证了从群体中完备的取样：CD11C阳性CD141阳性 (CD141;蓝绿色), CD11C阳性CD1C阳性(CD1C; 橙色), CD11C阳性CD141阴性 CD1C阴性 (“双阴性”; 蓝色), CD11C阴性CD123阳性 浆细胞树突状细胞 (pDCs; 紫色);每个96孔板用这四个门控装置能筛选出24个单细胞。第五个门控装置(CD11C阴性CD123阴性; 红色虚线)随后考察。(C) tSNE聚类分析。每个类的细胞数：DC1 (n = 166); DC2 (n = 105); DC3 (n = 95); DC4 (n = 175); DC5 (n = 30); DC6 (n = 171)。区别簇的基因中AUCge;0.85在簇旁列出。图聚类鉴定出的细胞分类用不同的颜色表示。每个点代表一个单细胞52。 |
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参考文献
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