酶的结构改造-插入非天然氨基酸的概述
摘要：将非天然氨基酸(NSAAs)插入到酶蛋白中能够产生新的化学性质、新的结构和新的功能。概述了酶的结构改造-插入非天然氨基酸的研究进展，主要从体外和体内两方面插入非天然氨基酸翻译蛋白质策略展开介绍，还阐述了基于非天然氨基酸的生物正交反应及其应用，并对其未来发展进行了展望。
关键词：非天然氨基酸；酶蛋白；正交翻译系统；点击反应
一、文献综述
在自然界中，遗传密码定义了64个三联密码子如何翻译成20个氨基酸。然而，遗传密码的合成扩展使非天然氨基酸 (NSAAs, Nonstandard amino acids) 可以直接翻译整合[1]。迄今为止，已将200多种不同的非天然氨基酸插入蛋白质中[2]。 非天然氨基酸的插入提供了增强的或新型的蛋白质特性，因此使该技术得以多样应用[3]。非天然氨基酸具备很多优良的特性，例如荧光性质，光敏感，氧化还原活性等[4]。非天然氨基酸的插入有助于操纵蛋白质的物理化学和生物学特性，从而实现了一系列有前景的应用，例如探测，成像和控制蛋白质功能的新方法以及精准的治疗方法[5]。尽管许多先前的研究已经说明了非天然氨基酸的应用，但是在该技术的实际应用中仍然存在许多挑战。
1. 体外插入非天然氨基酸翻译蛋白质策略
体外蛋白质翻译 (CFPS, Cell-free protein synthesis) 已经成为一种通用技术来补充基于细胞的蛋白质表达。体外蛋白质翻译是在不使用完整活细胞的情况下体外合成蛋白质的方法[6]。在过去的50年中，体外蛋白质翻译系统极大地提高了我们理解，利用和扩展生物系统功能的能力。作为体内系统的补充，体外蛋白质翻译系统提供了一些好处。首先，开放的反应环境允许用户可以直接影响生化系统的结果，可以添加或合成新的组分，并可以将其保持在精确的浓度下。例如，可以在体外蛋白质翻译中使用不进入该单元的非天然氨基酸。其次，无细胞系统不受细胞生存能力要求的限制，允许蛋白质合成与其他有毒的试剂或蛋白质产物一起进行。第三，体外蛋白质翻译系统可以将线性DNA片段（例如PCR产物）用于靶基因表达，这避免了繁琐的的克隆步骤来显着减少耗费的时间。
体外蛋白质翻译是利用通过制备细胞裂解液或重组纯化成分而获得的细胞翻译机制。通过添加DNA或mRNA的合适模板，蛋白质合成可直接用于所需蛋白质的生产。直到今天，体外蛋白质翻译都基于各种不同的来源，包括大肠杆菌、利什曼原虫、嗜热菌、小麦胚芽、烟草、昆虫、酵母、小鼠和人类细胞[7]均已被证明。可以使用不同的反应模式，使转录和翻译可以在一个反应容器中分别执行（链接模式）或同时执行（耦合模式）。缺少细胞质膜，体外蛋白质翻译的开放式环境可以直接操纵蛋白质翻译过程，从而实现量身定制的蛋白质生产。因此，体外蛋白质翻译是合成难以表达的蛋白质的有前途的工具。通常必须根据要表达的单个蛋白质来确定合适的合成条件，以获得适当折叠和功能化产物的最大产量。在这种情况下，原核系统的特征是具有较高的蛋白质产量，但是蛋白质需要执行复杂的翻译后修饰。磷酸化，糖基化和信号肽裂解，可以使用基于培养的真核细胞提取物的无细胞系统来改善功能性真核蛋白的合成。最后，从生物制造的角度来看，无细胞系统分离了催化剂合成(细胞生长)和催化剂利用(蛋白质生产)。这一概念与以细胞为基础、依赖于微观细胞反应器的过程有很大的不同。
2. 体内插入非天然氨基酸翻译蛋白质策略
